MiR-918的加工调节机制及其在红系分化中的功能研究

发布时间：2017-04-06 14:03

  本文关键词：MiR-918的加工调节机制及其在红系分化中的功能研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景：造血过程是人体内各类血细胞的发育、成熟的过程。整个造血分化过程涉及到三个阶段：第一个阶段是造血干细胞（hemopietic stem cells）阶段，这些造血干细胞能通过自我复制（self renewal）保持自身数量的稳定，同时又可以分化发育形成各系的定向祖细胞（committedprogenitors）；第二个阶段是定向祖细胞阶段，这个阶段包括红系祖细胞（CFU-E）、巨核系祖细胞（CFU-MK）、粒-单核系祖细胞（CFU-GM），和TB淋巴系祖细胞（CFU-TB）；第三个阶段是前体细胞（precursors）及其成熟阶段，这一阶段的细胞进一步分化成熟为具有各类特殊功能的终末血细胞，然后释放进入外周血液。红系分化是体内造血分化过程的重要分支。 miRNAs是一类具有18-25个核苷酸、非编码的微小调节性的RNA分子，主要在转录后水平调控基因的表达，参与生命调控的各个方面，并与多种疾病的产生相关。研究发现microRNAs（miRNAs）也参与了红系分化的调控过程。 目的:本论文主要研究miR-918的加工调节以及在红系分化中的作用机制。 方法：利用实时定量PCR（real-time PCR）筛选了一批与红系分化相关的miRNA,分别针对这些miRNA的primary、precusor、mature形式设计引物，用以检测在氯化血红素（hemin）诱导的K562细胞向红系分化过程中的表达变化，收集不同时间点的细胞，确定miR-918在红系分化的表达变化。通过5，-race实验和3，-race实验获得pri-918的全长转录本，进一步利用RBPDB软件队pri-918全长进行分析，将候选RNA结合蛋白的si-RNA转染到k562细胞中，hemin诱导向红系分化，利用real-time PCR方法检测miR-918primary和mature的表达变化。利用RNA-IP、RNA-EMSA、MS2-MBP实验验证QKI与miR-918的结合作用。 体外合成miR-918mimic，在细胞系中进行过表达，hemin诱导，用real-time PCR方法检测γ-globin的表达变化，用流式分析红系分化的表面标记CD235a/CD71的表达表达。随后在脐带血来源的CD34+干细胞中利用慢病毒进行miR-918的过表达，用流式细胞术检测相应变化。进一步构建可以降低QKI-5表达的质粒，转染K562细胞，检测r-globin的变化和红系分化表面标记的变化。 利用软件分析，找到miR-918的若干候选靶基因，将这些候选基因3’UTR区包含miRNA结合位点的序列克隆入荧光素酶报告基因的下游，与miR-918mimic共转染293TN细胞后检测报告基因的表达情况，采用双荧光实验和western blot实验进一步验证这些靶基因。 结果：miR-918在红系分化过程中有表达，实验证实RNA结合蛋白QKI-5和miR-918存在直接作用；过表达miR-918，使得hemin诱导的K562细胞中血红蛋白合成受阻，红系分化标志CD235a/CD71受到显著抑制，表明miR-918抑制红系分化。在原代培养的CD34+干细胞中过表达miR-918得到的结果与上述细胞系中一致。而且，抑制K562细胞中QKI-5表达后促进红系分化，表明QKI参与miR-918的加工成熟。 双荧光实验表明包含有TAL1和c MYB基因3’UTR的报告基因的表达可以被miR-918明显抑制；突变相应的结合位点序列，这种抑制作用消失。Western blot也证实在K562细胞中过表达miR-918， TAL1和c MYB蛋白的水平明显降低。上述结果表明TAL1和c-MYB是miR-918的直接靶基因，miR-918在红系分化中的调控机制可能是通过TAL1和c-MYB来实现。 结论：1、RNA结合蛋白QKI-5促进miR-918的加工成熟； 2、微小RNA miR-918抑制红系分化； 3、c-MYB和TAL1是miR-918在红系分化中的靶基因。
【关键词】：miR-918 红系分化 QKI-5 c-MYB TAL1
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R331.2
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-13
• 引言13-17
• 1 实验材料17-21
• 1.1 酶制品和分子量 Marker17
• 1.2. 主要生化试剂17
• 1.3. 培养基、血清及抗生素17-18
• 1.4. 细胞因子和生长因子18
• 1.5. 试剂盒18
• 1.6. 菌株18
• 1.7. 质粒18
• 1.8. 细胞系18
• 1.9. 人脐带血标本18-19
• 1.10. 生物信息学分析软件19
• 1.11. 主要仪器及设备19-21
• 2 实验方法21-39
• 2.1. 细胞学实验21-22
• 2.1.1 细胞系的培养21
• 2.1.2 细胞系的诱导21
• 2.1.3 细胞系的转染21-22
• 2.2. 造血干细胞的体外培养22-23
• 2.2.1 人脐带血标本的收集22
• 2.2.2 单个核细胞的分离和纯化22-23
• 2.2.3 CD34+造血干/祖细胞体外诱导红系分化23
• 2.2.4 流式细胞术(FACS)检测细胞表面分化 maker23
• 2.3. Real time PCR23-25
• 2.3.1 TRIZOl 法提取细胞总 RNA23-24
• 2.3.2 RNA 质量的检测24
• 2.3.3 M-MLV 合成 cDNA 第一链24-25
• 2.4. 重组质粒的构建25
• 2.5. 质粒 DNA 的提取25-26
• 2.5.1 质粒 DNA 的小量提取和定量25-26
• 2.6. 质粒 DNA 的大量制备及纯化26-27
• 2.7. 慢病毒的包装27
• 2.7.1 慢病毒的包装和收获27
• 2.7.2 慢病毒的浓缩27
• 2.7.3 慢病毒感染目的细胞27
• 2.8. Western blot27-29
• 2.8.1 蛋白的提取及定量27-28
• 2.8.2 蛋白的 SDS-PAGE 电泳28
• 2.8.3 蛋白电转移28
• 2.8.4 杂交28
• 2.8.5 二次免疫印迹28-29
• 2.9. 双萤光报告实验29
• 2.10. RNA EMSA 实验29-30
• 2.10.1 样品的制备29
• 2.10.2 制备-PAGE 电泳29
• 2.10.3 蛋白的电转移29-30
• 2.10.4 紫外交联30
• 2.10.5 杂交30
• 2.11. RNA IP(RNA Binding protein immunoprecipitation) 实验30-32
• 2.11.1 制备抗体包被的 protein A30
• 2.11.2 裂解细胞30-32
• 2.12. MS2 MBP 实验32-33
• 2.13. 5， race 实验33-36
• 2.13.1 磷酸化处理33
• 2.13.2 “去帽子”反应-使用 Tobacco Acid pyrophospharase（TAP）去掉 m RNA 的 5，帽子，保留一个磷酸集团33-34
• 2.13.3 5，-Race Adapter 连接34
• 2.13.4 反转录反应，按下列体系加入：34-35
• 2.13.5 outer PCR 反应35
• 2.13.6 inner PCR 反应35-36
• 2.14. 3,-Race 实验36-37
• 2.14.1 反转录反应，体系如下：36
• 2.14.2 套式 PCR 反应36-37
• 2.14.3 inner PCR 反应37
• 2.15 统计学分析37-39
• 3 实验结果39-51
• 3.1. 红系分化中 miRNA 的表达检测39-43
• 3.1.1 MiR-918 与红系分化相关39-40
• 3.1.2 pri-918 全长转录本的获得40
• 3.1.3 QKI-5 促进 miR-918 的加工40-41
• 3.1.4 RNA IP 实验验证 QKI 5 和 miR 918 的结合41-42
• 3.1.5 RNA EMSA 实验验证 QKI 5 和 miR 918 的直接结合42-43
• 3.1.6 MS2-MBP 实验验证 QKI-5 和 miR-918 的结合43
• 3.2. miR 918 在红系分化过程中的功能研究43-47
• 3.2.1 miR-918 基因结构分析43-44
• 3.2.2 miR-918 在红系分化中的表达44-45
• 3.2.2.1 hemin 诱导 K562 细胞向红系分化44
• 3.2.2.2 定向诱导 CD34+向红系分化44-45
• 3.2.3 miR 918 在红系分化中的功能45-47
• 3.2.3.1 过表达 miR-918 对 K562 的影响45-46
• 3.2.3.2 过表达 miR-918 对 CD34+造血干细胞分化的影响46-47
• 3.3. QKI 5 在红系分化中的功能研究47-48
• 3.3.1 QKI-5 在 K562 红系分化中的功能47-48
• 3.4. miR 918 作用于红系分化的分子机制研究48-51
• 3.4.1 miR-918 靶基因的预测和初步验证48-49
• 3.4.2 miR-918 靶基因的突变位点分析49
• 3.4.3 miR-918 靶基因的 western blot 验证49-51
• 4 结论51-53
• 5 讨论53-57
• 5.1 在细胞核中 miRNA 的生物起源和加工过程53-54
• 5.2 miRNAs 在细胞质的加工过程54
• 5.3 红系分化中重要的转录因子54-57
• 参考文献57-63
• 文献综述63-75
• 参考文献71-75
• 致谢75-76
• 攻读硕士期间发表和待发表的学术论文76-77

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 胡欣春;魏益平;彭金华;喻东亮;徐建军;;miR-4686对A549细胞球增殖的调控作用及其机制研究[J];第三军医大学学报;2014年04期

2 傅军;吴雪英;王守铭;;微小RNA与乳腺癌侵袭转移关系的研究进展[J];福建医药杂志;2014年01期

3 董宁;葛高霞;张炜明;朱伟;徐华国;;XIAP基因3′非翻译区荧光素酶报告载体的构建及活性分析[J];国际检验医学杂志;2014年09期

4 刘莎;孙国平;;miRNA145作为抑癌基因在胃癌中的表达及其功能研究[J];安徽医药;2014年10期

5 聂静;吴正升;朱敬凤;黄山;吴强;;Has-miR-339-5p对裸小鼠人乳腺癌移植瘤形成及生长的影响[J];临床与实验病理学杂志;2014年03期

6 车艳红;卢爱妮;廖予妹;;miR-143在宫颈癌组织中表达及临床意义的初步研究[J];医学研究生学报;2014年05期

7 王琳;娄加陶;;microRNA-128a对非小细胞肺癌细胞增殖和迁移的影响[J];上海交通大学学报(医学版);2014年03期

8 朱迎;陈妍珂;董健;王晓霏;吕毅;程继文;;miR-519在肿瘤中的研究进展[J];现代肿瘤医学;2014年04期

9 吴雄辉;余祖虎;贺蓉;倪梁朝;桂耀庭;杨尚琪;来永庆;;肾癌中miR-142-3p表达分析及临床意义研究[J];现代泌尿生殖肿瘤杂志;2014年02期

10 胡晓薇;刘丹;王金彩;刘文涛;杨玉光;吴瑾;;miRNA-105在胃癌组织中的表达情况[J];现代生物医学进展;2014年16期

中国博士学位论文全文数据库 前9条

1 郭继刚;microRNA在神经母细胞瘤转移及骨肉瘤发生过程中的研究[D];南京大学;2011年

2 白立景;猪骨骼肌发育中相关miRNA的鉴定及miR-21生物学功能研究[D];中国农业大学;2014年

3 张茁;miRNA介导选择性表达肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体抑制肾癌细胞生长[D];吉林大学;2014年

4 陆洋;MiR-200a对人胰腺癌干细胞上皮—间质转化（EMT）及体外生物学行为影响的实验研究[D];苏州大学;2014年

5 孙允霄;顺铂通过miR-16下调BDNF表达抑制SH-SY5Y细胞生长的研究[D];山东大学;2014年

6 陈佳佳;基于转录组学数据的癌症转化医学信息学[D];苏州大学;2013年

7 王翠萍;hsa-miR-483-3p在胰腺导管腺癌中表达及功能的初步研究及对肾上腺皮质肿瘤诊断和预后的意义研究[D];北京协和医学院;2014年

8 郭琼;miR-375及MTDH在前列腺癌细胞中的功能研究[D];中南大学;2013年

9 陈晓宇;不同病理类型胶质瘤标本MiRNA表达谱分析及MiR-125a-5p在GBM中生物学功能的研究[D];中南大学;2014年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 李勉;miR-222、miR-125b与弥漫大B细胞淋巴瘤临床、病理及预后的关系[D];华中科技大学;2013年

2 陈宏伟;MiRNA-34a在宫颈癌组织中的表达及调控[D];南昌大学医学院;2013年

3 唐志斌;姜黄素上调miR-124抑制人骨肉瘤细胞MG-63增殖和侵袭的机制研究[D];南华大学;2012年

4 李利廷;结直肠癌中microRNA-150的表达与p21、p27的关系及其对细胞增殖的影响[D];河北医科大学;2014年

5 张月静;miR-21-4T1细胞的构建及其exosome功能的初步研究[D];河北医科大学;2014年

6 杨伟琼;miR-30d通过自噬调控影响未分化型甲状腺癌细胞对顺铂治疗敏感性的研究[D];苏州大学;2014年

7 沈旦;MiR-205调控非小细胞肺癌细胞发生上皮—间充质转化过程的机制研究[D];苏州大学;2014年

8 张宁;MiR-342在肝癌组织中过度表达的研究[D];山东大学;2014年

9 赵明;MiRNA137和miRNA29a在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义[D];南京大学;2012年

10 段卫明;SATB1与相关MicroRNA在乳腺癌中的表达研究[D];苏州大学;2014年

  本文关键词：MiR-918的加工调节机制及其在红系分化中的功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：288968