人树突状细胞cDNA文库大规模测序体系的建立及新型细胞因子CX1的发现与功能研究

发布时间：2020-11-18 17:55

　　 人类基因组计划是生命科学领域的一项跨世纪工程,目的在于获得人类的全部基因组信息,揭示人类生命的奥秘及疾病的发生发展规律,最终探索出疾病诊治的有效方法。随着分子生物学和计算机技术、生物信息学的发展,大规模测序已成为揭示细胞基因表达谱和发现新分子的有效手段。树突状细胞(Dendritic cells, DC)为体内重要的专职抗原提呈细胞(APC),是机体T细胞特异免疫应答的直接启动和调控者。近年来,树突状细胞的分化发育、抗原加工提呈机理及其在肿瘤、感染、自身免疫性疾病和移植排斥中的作用已经成为免疫学的前沿领域,从树突状细胞中寻找免疫新分子是目前免疫学领域的一大研究热点。为了深入认识DC的生物学功能,阐明其生物学作用的分子机理,我们在以往树突状细胞研究工作的基础上,建立了人树突状细胞cDNA基因文库的大规模随机测序体系,以期寻找和发现具有我国自己知识产权的免疫新分子。 一.人树突状细胞cDNA质粒文库的构建及其大规模测序体系的建立 用重组人GM-CSF和IL-4培养健康成人外周血单核细胞,获取单核细胞来源的人树突状细胞。收集培养至第7天的悬浮细胞,FACS检测显示其表达树突状细胞特异性标志CD1a及CD83,此外高表达HLA-A,B,C、HLA-DR、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、CD40和CD54等免疫分子,而单核细胞特异性标志CD14几乎不表达(5%),细胞纯度达90%以上;同种异体混合淋巴细胞反应(MLR)显示其能显著刺激同种异体T淋巴细胞增殖,表明所获得的树突状细胞纯度高并具有免疫刺激活性。从2×107人树突状细胞提取细胞总RNA 200μg,经两次磁珠选择方法纯化poly A+ RNA,获得5μg mRNA。对纯化的mRNA分别进行人树突状细胞特异表达的趋化因子DC-CK1和膜表面标记分子DEC205(6928bp)的RT-PCR和5’端的cDNA末端的快速扩增(RACE)分析,表明mRNA群体中含有这两种树突状细胞特异表达的全长分子。取4μg人树突状细胞mRNA,采用Life Technologies公司的SuperscriptTM质粒文库试剂盒,构建人树突状细胞的cDNA质粒文库。mRNA在NotI-Oligo dT的引导下合成第一链,第二链合成后,末端加上SalI适配子,经NotI酶切后,定向插入pSPROT2载体,经电穿孔转化大肠杆菌DH10B,原始文库经半固体培养后-80°C保存。经SalI/NotI酶切鉴定分析,
【学位单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：1999
【中图分类】：R392
【文章目录】：
中文摘要
ABSTRACT
第一部分 人树突状细胞cDNA 基因文库的建立及其大规模随机测序体系的建立
第二部分 人树突状细胞cDNA 文库随机测序结果的分析及新分子的克隆
第三部分 新型细胞因子CX1 全长cDNA 的克隆及其表达确证
第四部分 细胞因子CX1 的重组表达及其活性研究
第五部分 细胞因子CX1 原核分泌表达的研究
小结
致谢
附录
综述

【参考文献】

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本文编号：2889011