XPD对ox-LDL促人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

发布时间：2017-04-07 07:03

  本文关键词：XPD对ox-LDL促人脐静脉内皮细胞凋亡的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的: 本研究在首先发现人静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell，HUVEC)表达剪切修复基因D（xeroderma pigmentosum D，XPD）的基础上，以氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）建立人脐静脉内皮细胞凋亡模型，观察XPD在血管内皮细胞凋亡时的表达；同时沉默内皮细胞XPD基因的表达后，观察ox-LDL诱导内皮细胞的凋亡情况，探讨XPD-siRNA对ox-LDL诱导内皮细胞凋亡的影响及机制。 方法： 1、培养人脐静脉内皮细胞，RT-PCR检测XPD mRNA表达。 2、以氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）建立人脐静脉内皮细胞凋亡模型，培养基中ox-LDL终浓度分别为50μg/m l、100μg/m l、150μg/m l、200μg/m l，孵育24小时。通过MTT检测细胞活力，筛选ox-LDL最佳作用浓度，建立人脐静脉内皮细胞凋亡模型。 3、用Western Blottig检测经ox-LDL处理的HUVEC中XPD的蛋白表达变化。 4、设计并化学合成3对靶向XPD的siRNA，，即XPD-siRNA-1、XPD-siRNA-2、XPD-siRNA-3，利用脂质体转染HUVEC。通过Western Blotting检测XPD蛋白的表达，筛选出最佳干扰序列用于后续实验。 5、将最佳干扰序列转染内皮细胞，并经最佳浓度的ox-LDL孵育24小时。将实验分6组：a.空白对照组；b.阴性对照siRNA组；c. XPD-siRNA组；d.ox-LDL组；e. ox-LDL+阴性对照siRNA组；f. ox-LDL+XPD-siRNA组。 6、用MTT法测定各组细胞的存活率；流式细胞仪检测各组细胞凋亡率；提取各组细胞的蛋白通过Western Blottig检测XPD、Bcl-2和Bax蛋白的表达情况；提取各组细胞的RNA通过RT-PCR检测XPD、Bcl-2和Bax基因的表达情况。 7、统计方法：采用SPSS13.0统计学软件分析，实验所得数据以均数±标准差表示。P0.05为差异有统计学意义。 结果： 1、人脐静脉内皮细胞表达人剪切修复基因D（XPD）。 2、浓度为50～200μg/ml的ox-LDL作用HUVEC24h，均能破坏其活力与凋亡之间的平衡，其中100μg/ml为最佳作用浓度。 2、XPD在经不同浓度ox-LDL处理的HUVEC中表达均增加。 3、3对XPD-siRNA均能有效抑制HUVEC中XPD的表达，其中以XPD-siRNA-2沉默效率最高,为（76.15±2.14）%。 4、MTT结果显示， XPD-siRNA组的细胞活力较空白对照组增加（140.43±4.26VS100, p0.05），ox-LDL+XPD-siRNA组的细胞活力较ox-LDL+阴性对照siRNA组明显增加（110.91±3.22VS70.58±4.67, p0.05）。 5、流式细胞仪的结果显示，XPD-siRNA组的细胞凋亡率较空白对照组降低（2.0±0.30VS5.17±0.16, p0.05），ox-LDL+XPD-siRNA组的细胞凋亡率较ox-LDL+阴性对照siRNA组明显降低（15.26±0.74VS28.32±0.63, p0.05）。 6、RT-PCR和Western Blotting结果发现，与空白对照组相比，XPD-siRNA组XPD表达降低，分别为（0.11±0.01VS0.32±0.01, p0.05）和（0.1±0.0.01VS0.49±0.0.01, p0.05）；Bcl-2表达增高，分别为（0.35±0.02VS0.15±0.02, p0.05）和（0.24±0.0.02VS0.07±0.02, p0.05）；Bax表达降低，分别为（0.1±0.01VS0.53±0.02, p0.05）和（0.07±0.01VS0.37±0.02, p0.05）。 7、RT-PCR和Western Blotting结果还发现，与ox-LDL+阴性对照siRNA组相比，ox-LDL+XPD-siRNA组XPD表达降低，分别为（0.45±0.02VS0.65±0.01,p0.05）和（0.25±0.0.01VS1.06±0.01, p0.05）；Bcl-2表达增高，分别为（0.24±0.02VS0.09±0.06, p0.05）和（0.15±0.01VS0.04±0.00, p0.05）；Bax表达降低，分别为（0.49±0.03VS0.89±0.01, p0.05）和（0.19±0.01VS0.83±0.01, p0.05）。 结论： 1、XPD在HUVEC中有表达，ox-LDL诱导HUVEC表达XPD基因上调。 2、XPD介导ox-LDL诱导HUVEC凋亡。 3、XPD介导ox-LDL诱导HUVEC凋亡的可能机制与Bax和Bcl-2表达有关。
【关键词】：剪切修复基因XPD 人脐静脉内皮细胞 ox-LDL 细胞凋亡
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 第1章 引言10-11
• 第2章 材料与方法11-25
• 2.1 材料11-15
• 2.1.1 细胞株11
• 2.1.2 主要试剂11-12
• 2.1.3 自配试剂12-14
• 2.1.4 主要仪器设备14-15
• 2.2 方法15-25
• 2.2.1 人脐静脉内皮细胞培养15-16
• 2.2.2 RT-PCR 检测内皮细胞中 XPD 的基因表达16
• 2.2.3 建立 ox-LDL 促内皮细胞凋亡模型16-17
• 2.2.4 Western Blottig 检测内皮细胞凋亡模型中 XPD 的表达变化17
• 2.2.5 设计与合成靶向 XPD 的 siRNA 序列17-18
• 2.2.6 内皮细胞的转染18-19
• 2.2.7 MTT 法测定细胞活力19
• 2.2.8 流式细胞仪检测细胞凋亡率19
• 2.2.9 Western Blotting 检测 XPD、Bcl-2、Bax 蛋白的表达19-22
• 2.2.10 RT-PCR 检测 XPD、Bcl-2、Bax 基因的表达22-24
• 2.2.11 统计学分析24-25
• 第3章 结果25-31
• 3.1 XPD 在 HUVEC 中基因表达25
• 3.2 不同浓度的 ox-LDL 对内皮细胞存活率的影响25-26
• 3.3 XPD 在内皮细胞凋亡模型中的表达变化26
• 3.4 筛选最佳 XPD-siRNA26-27
• 3.5 XPD-siRNA 和 ox-LDL 对内皮细胞存活率和凋亡率的影响27-28
• 3.6 XPD-siRNA 和 ox-LDL 对 XPD、Bcl-2、Bax 蛋白表达的影响28-29
• 3.7 XPD-siRNA 和 ox-LDL 对 XPD、Bcl-2、Bax 基因表达的影响29-31
• 第4章 讨论31-37
• 4.1 内皮细胞凋亡与心血管疾病31-32
• 4.2 靶向 XPD 的最佳 siRNA 的筛选32-33
• 4.3 XPD 与内皮细胞凋亡33-34
• 4.4 XPD-siRNA 抑制内皮细胞凋亡的可能机制34-37
• 第5章 结论37-38
• 1、XPD 在 HUVEC 中有表达37
• 2、XPD 介导 ox-LDL 诱导 HUVEC 凋亡37
• 3、XPD 介导 ox-LDL 诱导 HUVEC 凋亡的可能机制与 Bax 和 Bcl-2 表达有关37-38
• 致谢38-39
• 参考文献39-43
• 攻读学位期间的研究成果43-44
• 综述44-51
• 参考文献49-51

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 ;XPD Lys751Gln polymorphism and esophageal cancer risk: A meta-analysis involving 2288 cases and 4096 controls[J];World Journal of Gastroenterology;2011年18期

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本文编号：289861