A型肉毒毒素（BoNT/A）表位多肽单克隆抗体的制备及其效价评定

发布时间：2020-12-05 08:32

　　一、研究背景和目的肉毒梭菌（Clostridium botulinum）是一种厌氧的、革兰氏阳性的孢子形成菌,肉毒毒素（botulinum neurotoxin,BoNT）是由肉毒梭菌分泌的一种神经毒素,是所发现的生物毒素和化学毒素中毒性最强的物质,它可以作用于周围运动神经末梢,神经肌肉接点即突触处,抑制突触前膜释放神经介质-乙酰胆碱,从而引起肌肉松驰性麻痹[1]。食品污染、婴儿肠道感染及伤口感染是引起人类肉毒毒素中毒的主要原因[2]。肉毒毒素共包含A-G七种血清型,A、B型是人类肉毒中毒的常见型别,E、F型偶尔引起食物中毒流行,C、D型则仅引起动物中毒,G型极少见。各型肉毒毒素分子在结构和功能上有很多相似的特点：均由重链（H链,相对分子质量为100KD）和轻链（L链,相对分子质量为50KD）组成,二者由1个二硫键连接。重链的羧基末端（Hc）,又称为受体结合区,它负责与靶细胞的结合；重链N端（HN结构域）为一个跨膜转运功能区域,而轻链具有锌离子肽链内切酶活性。结合、转运和催化这3个功能区域呈线性排列,转运区域位于中间[3]。催化区域为由α-螺旋和β-折叠组成的紧实的球形结构,转运区域主... 

【文章来源】：南方医科大学广东省

【文章页数】：82 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
前言
    1 研究目的和意义
    2 肉毒毒素研究进展
        2.1 毒素的来源和分布
        2.2 肉毒毒素的理化性质和提取方法
        2.3 肉毒毒素结构和作用方式
        2.4 BoNT检测及预防
        2.5 肉毒毒素中毒特点和预防
第一章 A型肉毒毒素重链C末端保护性抗原的制备
    1.1 材料
        1.1.1 网上GeneBank检索获得A型肉毒毒素的蛋白序列及三维立体结构
        1.1.2 DNASTAR蛋白分析软件
        1.1.3 B细胞表位优势区域的平均抗原性指数（AI）评分标准
        1.1.4 网络服务器分析系统ExPasy系统
    1.2 方法
        1.2.1 A型肉毒毒素重链C末端抗原表位的预测
        1.2.2 A型肉毒毒素重链C末端抗原多肽的合成
    1.3 结果
        1.3.1 A型肉毒毒素重链C末端抗原表位的预测
        1.3.2 合成多肽的质谱分析结果
    1.4 讨论
第二章 BoNT/A抗原表位单克隆抗体的制备与检测
    2.1 材料
        2.1.1 主要试剂
        2.1.2 仪器设备
        2.1.3 细胞
        2.1.4 培养基和缓冲液
    2.2 方法
        2.2.1 多肽合成抗原的制备
        2.2.2 小鼠免疫
        2.2.3 饲养细胞的制备
        2.2.4 脾淋巴细胞的制备
        2.2.5 髓瘤细胞的准备
        2.2.6 细胞融合
        2.2.7 融合细胞的培养
        2.2.8 筛选（Screening）
        2.2.9 克隆（Cloning）
        2.2.10 体外扩大培养
        2.2.11 细胞冻存
        2.2.12 小鼠腹水制备
        2.2.13 腹水抗体效价的测定
        2.2.14 亚类鉴定
        2.2.15 腹水抗体的纯化
        2.2.16 抗体纯度的鉴定
        2.2.17 蛋白绝对含量测定
        2.2.18 抗体效价测定
        2.2.19 抗体特异性检测
    2.3 结果
        2.3.1 细胞融合
        2.3.2 杂交瘤克隆化结果
        2.3.3 单抗分型
        2.3.4 抗体效价测定
        2.3.5 单抗纯化结果
        2.3.6 稳定性实验
        2.3.7 抗体特异性检测
    2.4 讨论
        2.4.1 融合和阳性株筛选
        2.4.2 关于单抗的纯化方法
        2.4.3 肉毒毒素研究存在的问题
第三章 全文小结
参考文献
英文缩略词表
硕士期间完成的论文
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]A型肉毒毒素保护性抗原基因的克隆及其结构分析[J]. 王慧,荫俊,袁斌,何君,王忠泽.  生命科学研究. 2001(04)
[2]人DAO氨基酸序列片段B-细胞表位的多参数预测[J]. 陈兴,王更银,丛爱丽,张立,许素菊.  免疫学杂志. 2000(03)
[3]蛋白顺序性抗原决定簇的多参数综合预测[J]. 万涛,孙涛,吴加金.  中国免疫学杂志. 1997(06)
[4]PCR 检测产 A、B、E、F 和 G 型肉毒神经毒素梭菌的神经毒素基因[J]. 王颖群,严共华,雷祚荣.  中华微生物学和免疫学杂志. 1997(03)
[5]A new approach for B-cell epitope prediction in viral proteins[J]. 吴玉章,朱锡华.  Chinese Science Bulletin. 1995(09)
[6]治疗用A型肉毒结晶毒素的研制及实验动物模型的建立[J]. 王荫椿,张晖,黄保国,戴壮.  生物制品学杂志. 1990(03)
[7]肉毒中毒—“察布查尔病”的调查报告[J]. 吴朝仁,连志浩,陈文俊,刘玉璋,梁秀,李文惠,成勋,赵怀桂.  中华医学杂志. 1958 (10)



本文编号：2899199