恶性疟原虫乳酸脱氢酶基因的克

发布时间：2020-12-06 17:33

　　疟疾是严重危害人类健康的虫媒传染病，广泛流行于热带和亚热带一些发展中国家。疟疾的诊断是疟疾防治工作中的一个重要环节，当前疟疾的发病率和死亡率难以控制的一个重要原因就是在疟疾流行区缺乏有效的诊断和治疗手段。传统依靠厚血膜镜检诊断方法已越来越不能适应当前疟疾诊断的需要。QBC法及Kawamoto法虽然敏感性比血涂片镜检法提高了8倍以上，特异性达98.4％，但其所使用的毛细管价格昂贵（每支0.8美元），又不能重复使用，操作上也较繁琐，且难以有效地进行虫株鉴别及虫体计数，因此难以在基层推广应用。八十年代以来随着分子生物学的发展而出现的基因诊断技术（分子杂交，PCR、套式PCR、荧光定量PCR等），显示了较高的敏感性和特异性，且能对疟原虫的感染作出早期快速的诊断，但也存在着需要特殊仪器设备和反应试剂较昂贵的问题。以免疫学为基础的血清学检测，特别是近几年来发展的以单抗为基础的Dipstick技术，由于操作简便、快速，结果易于判定，在疟疾诊断上日渐受到重视并展示了广阔的应用前景。目前美国、澳大利亚等已开发出ParaSight-F（Becton Dickinson，Cockeysoville，Mary... 

【文章来源】：南方医科大学广东省

【文章页数】：116 页

【学位级别】：博士

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前言
第一部分 恶性疟原虫乳酸脱氢酶重组表达质粒的构建及鉴定
    材料和方法
        一、 材料
        二、 实验方法
            （一） 引物设计
            （二） 恶性疟原虫基因组DNA的提取
            （三） PCR扩增
            （四） LDHpf基因的克隆
                1. 质粒DNA的制备及酶切
                2. 目的基因片段LDH的纯化、酶切
                3. 目的片断的分离和回收
                4. 目的基因片断与载体的连接反应
                5. 感受态细胞的制备
                6. 转化
            （五） 重组克隆的筛选及鉴定
                1. 初步鉴定
                2. PCR鉴定
                3. 酶切鉴定
            （六） LDHpf基因序列测定及同源性分析
    结果
        一、 LDH基因的扩增
        二、 重组克隆的筛选及鉴定
        三、 序列的测定及同源性分析
    讨论
    小结
第二部分 重组蛋白的表达、纯化及免疫原性研究
    一、 材料
    二、 实验方法
        （一） LDH基因的诱导表达
        （二） 表达产物SDS-PAGE分析
        （三） 表达产物酶活性测定
        （四） 表达产物的纯化
        （五） 表达产物抗原性分析
            1. ELISA
            2. Western-blot
            3. 免疫血清的制备
            4. 免疫血清的鉴定
    结果
        一、 重组质粒的表达
            （一） 表达条件的优化
                1. 诱导时机
                2. 诱导时间
                3. 诱导剂浓度
            （二） 表达产物酶活性测定
        二、 表达蛋白的纯化
        三、 表达产物免疫学鉴定
        四、 多抗制备及鉴定
    讨论
    小结
第三部分 单克隆抗体的制备及鉴定
    一、 材料
    二、 实验方法
        （一） 抗原制备
        （二） 动物免疫
        （三） 细胞融合
        （四） 阳性克隆的筛选与克隆化
        （五） 单克隆抗体的Ig类与亚类鉴定
        （六） 杂交瘤细胞的染色体分析
        （七） 诱生腹水
        （八） 效价测定
        （九） 单克隆抗体的SDS-PAGE分析
        （十） 单克隆抗体特异性鉴定
            1. ELISA
            2. Dot-ELISA
            3. Western-blot
    结果
        一、 杂交瘤细胞株的建立
        二、 单克隆抗体的类及亚类
        三、 单克隆抗体的效价
        四、 染色体鉴定
        五、 单克隆抗体的SDS-PAGE分析
        六、 单克隆抗体特异性鉴定
    讨论
    小结
第四部分 疟疾的诊断研究
    一、 材料
    二、 实验方法
        （一） 镜检
        （二） PCR检测
            1. 模板DNA制备
            2. PCR反应
            3. PCR产物的序列测定
        （三） ICT2检测
            1. ICT2测试卡操作
            2. 结果判定
        （四） 免疫胶体金层析检测
            1. 单抗的纯化
            2. 直径20～30nm胶体金的制备
            3. 最适蛋白质浓度测定
            4. 胶体金的标记
            5. 免疫胶体金层析试纸条的制作
            6. 反应模式的建立
            7. 最低检测量的测定
            8. 疟疾血样的检测
            9. 稳定性检测
        （五） 酶活性检测
            1. 电泳法
            2. 酶比色法
                2.1. 不同原虫感染率LDHpf活性的检测
                2.2. 培养时间对LDHpf活性的影响
                2.3. LDHpf活性用于监测药物疗效的初步研究
        （六） 免疫捕获LDH活性检测法
        （七） 数据处理
    结果
        一、 镜检
        二、 PCR检测
        三、 ICT2检测
        四、 免疫胶体金层析法（GICA）检测
            （一） 单抗的纯化
            （二） 1ml胶体金的最适标记量的试验
            （三） 免疫胶体金层析法模式的建立
            （四） 最低检测量的测定
            （五） 疟疾血样检测
            （六） 稳定性测试
        五、 LDH活性检测法
            （一） 电泳法
            （二） 酶比色法
                1. 不同原虫感染率LDHpf活性的检测
                2. 培养时间对LDHpf活性的影响
                3. LDHpf活性用于监测药物疗效的初步研究
        六、 免疫捕获LDH活性检测法
    讨论
        一、 PCR法
        二、 免疫胶体金层析检测
            （一） ICT2检测
            （二） 以LDHpf单抗为基础的免疫胶体金层析法检测
        三、 酶活性检测
        四、 免疫捕获LDH活性检测法
    小结
总结
参考文献
致谢
综述一
综述二
附录1： 博士期间论文发表情况
附录2： Genbank登录情况


【参考文献】：
期刊论文
[1]胶体金免疫结合试验在检验医学中的应用[J]. 王培之,徐克沂,皮国华.  中华检验医学杂志. 2000(05)
[2]疟原虫乳酸脱氢酶活性检测法和有限稀释法在筛选和建立恶性疟原虫克隆株时的应用[J]. 董莹,李菊曰升,高白荷.  实用寄生虫病杂志. 2000(02)
[3]恶性疟原虫荧光定量聚合酶链反应检测方法的建立[J]. 江晓玲,李明,徐伟文,毕惠祥,程钢,李虎,诸欣平.  中华检验医学杂志. 2000(02)
[4]快速免疫色谱测试卡诊断恶性疟和间日疟的效果评价[J]. 郑香,汤林华,许永湘,蒙锋,祝卫东,顾政诚,钱会霖.  中国寄生虫学与寄生虫病杂志. 1999(04)
[5]恶性疟原虫乳酸脱氢酶的快速电泳法检测及影响因素[J]. 刘玉冰,王福勇,刘瑞娟,余志伟,王辉东,程义亮.  中国人兽共患病杂志. 1999(02)
[6]恶性疟原虫乳酸脱氢酶活性的初步检测[J]. 符式刚,邢奇芬,庞启滨.  海南医学. 1999(01)
[7]通过电子邮件开展核酸和蛋白质序列分析[J]. 胡德华,方平.  生命的化学. 1999(01)
[8]聚合酶链反应检测间日疟原虫的现场应用研究[J]. 李雪宏,黄海燕,张淑贞.  中国寄生虫病防治杂志. 1998(03)
[9]套式PCR扩增特定SSrRNA基因片段诊断间日疟及混合感染的研究[J]. 诸欣平,李明,董洁,周蕾,王学忠,王凤云.  中国寄生虫病防治杂志. 1998(02)
[10]快速免疫色谱测试法诊断恶性疟的初步观察[J]. 祝卫东,汤林华,郑香,罗曼珍,顾政诚,钱会霖,瞿靖琦.  中国寄生虫学与寄生虫病杂志. 1998(02)



本文编号：2901767