CpG-ODN c41免疫特性及无刺激性内化机制研究

发布时间：2017-04-07 13:15

  本文关键词：CpG-ODN c41免疫特性及无刺激性内化机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：在固有免疫中，TLR9能特异性识别微生物非甲基化CpG-DNA（CpG-ODN），激发MyD88信号级联，释放促炎因子TNF-α，IL-6等，对消除病原体入侵具有十分重要的意义。然而，当TLR过度活化，大量促炎因子释放，又会引起针对宿主自身的炎性病理损伤。在前期研究中，本课题组新发现的一种特殊的CpG-ODN分子，命名为CpG-ODN c41（CpG-c41），它内化入胞后并不引起细胞因子释放，无免疫刺激性。由此我们将CpG-c41的内化称为“无刺激性内化”。此外，CpG-c41能抑制刺激性CpG-ODN诱导的促炎因子释放，具有显著的抑炎作用，但其分子作用机制和免疫特性尚不完全清楚。本课题从多角度对CpG-c41的免疫特性，及其对TLR9信号通路抑制机制进行深入研究。 此外，在TLR9信号抑制途径研究中，除了作为TLR9配体的CpG-c41之外，miRNA作为一种负调控机制也引起了广泛关注。为了突破实验方法的局限性，寻找更多的与TLR9乃至整个Toll-样受体家族信号通路相关miRNA，本研究建立了一种目前最为完整的直接从前体miRNA预测成熟miRNA的miRNA预测模型，FOMmiR，并尝试用FOMmiR从非编码RNA中预测成熟miRNA后，在整个Toll-样受体信号通路相关分子的mRNA3’UTR中进行局部序列比对（Blast），探索miRNA的靶基因。 CpG-c41产生的TLR9信号通路抑制机制研究，以及探寻Toll-样受体相关信号通路miRNA有助于为临床抗炎抗过敏治疗提供新的策略。 目的： 明确CpG-c41的免疫特性及其无刺激性内化的机制，包括CpG-c41与刺激性CpG-ODN之间的竞争入胞如何发生，以及这种竞争在信号通路中所处位置。并建立准确的miRNA预测模型，探寻TLR9信号通路相关miRNA。 方法： 1.通过ELISA实验观察不同剂量CpG-c41对CpG-1826诱导的TLR9活化的影响，CpG-c41对CpG-1826诱导的TLR9活化不同的影响，CpG-c41对小鼠巨噬细胞免疫应答能力的影响； 2.采用免疫荧光实验和激光共聚焦定位来观察CpG-c41在胞内的内化转运过程； 3.采用蛋白印记实验检测在CpG-c41作用下TLR9-MyD88下游信号通路的活化情况； 4.运用生物信息学方法建立miRNA预测模型，并探寻TLR9信号通路相关miRNA。 结果： 1. CpG-c41作用细胞后，不引起细胞因子释放，表现出无免疫刺激性。 2. CpG-c41与CpG-1826同时作用于细胞情况下， CpG-c41能够有效抑制CpG-1826诱导的炎性细胞因子释放，产生了抑炎作用，且存在显著的量效关系。 3.在CpG-1826诱导的TLR9活化的不同时相点加入CpG-c41，对TLR9早期TNF-α释放和晚期IL-6均有显著的抑制作用，且越早加入CpG-c41，抑制效果越明显。 4. CpG-1826作用细胞24h后，显微镜观察到明显的凋亡泡，而CpG-c41作用后的细胞细胞形态正常。接受再次CpG-1826刺激时，CpG-1826预处理组丧失免疫应答能力，细胞因子释放水平显著降低；CpG-c41预处理组免疫应答能力受影响较小，细胞因子释放保持较高水平。 5.免疫荧光实验结果显示CpG-c41在早期内体中被TLR9识别。 6.蛋白印记实验结果显示CpG-c41并未激活TLR9-MyD88信号通路的下游通路；较单独CpG-1826刺激，用CpG-c41和CpG-1826的混合物作用于细胞后MyD88信号级联的下游子通路均受到显著的抑制。 7.建立了一种新的基于二级结构模式的定阶马尔科夫模型的miRNA预测算法，FOMmiR实现了从发夹结构序列预测成熟miRNA的全功能识别。 8.通过将由FOMmiR从非编码RNA中预测的成熟miRNA的反向互补链与Toll-样受体信号通路相关分子的mRNA3’UTR序列进行Blast比对，发现785条序列的907条miRNA与82个基因之间存在1340个交互作用，其中2条miRNA（miR-15a和miR-146a）在文献中有报道。 结论： 1. CpG-c41的免疫学特性 CpG-c41对刺激性CpG-ODN的抑炎效应具有显著的量效关系与时效关系。CpG-c41与CpG-1826浓度比为1:1时，TNF-α释放水平降低约50%，当浓度比为4:1时，TNF-α释放水平降低超过90%。在刺激性CpG-ODN作用细胞3h内加入CpG-c41，对早期TNF-α释放均有显著的抑制效果，30min中内加入效果最好；后期在20h内加入CpG-c41对晚期IL-6的释放均有显著的抑制效果，在16h之前加入效果更明显。 2. CpG-c41的抑炎作用机制 免疫荧光结果显示CpG-c41通过比CpG-1826更高效的内化过程入胞，并在早期内体中被TLR9识别。正是CpG-c41对受体的高亲和力使其与刺激性CpG-ODN争夺受体，阻碍了刺激性CpG-ODN内化入胞与TLR9结合。 尽管CpG-c41与TLR9发生结合，然而蛋白印记结果显示CpG-c41并未激活TLR9-MyD88信号通路的下游NF-κB和MAPKs通路，因此CpG-c41并不引起细胞因子的释放，无免疫刺激性。加入CpG-c41后，CpG-1826诱导的TLR9-MyD88信号通路的下游通路活性显著降低，从而产生抑炎效应。 3. TLR9通路相关miRNA 为了突破实验方法的局限性，寻找更多的与TLR9乃至整个Toll-样受体家族信号通路相关miRNA，我们建立了一种最为完整的直接从前体miRNA预测成熟miRNA的miRNA预测模型，FOMmiR。并尝试用FOMmiR从非编码RNA中预测成熟miRNA，并在整个Toll-样受体信号通路相关分子的mRNA3’UTR中进行局部序列比对（Blast），探索miRNA的靶基因，结果中有2条miRNA已有文献报道。
【关键词】：TLR9 CpG-c41 无刺激性内化 FOMmiR miRNA
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 缩略语表4-6
• Abstract6-10
• 中文摘要10-13
• 第一章 前言13-17
• 1.1 选题缘由13
• 1.2 研究背景13-14
• 1.3 研究意义14-15
• 1.4 研究内容15
• 1.5 研究方法15-17
• 第二章 CpG-c41 的免疫特性17-27
• 2.1 材料和方法17-20
• 2.2 结果20-25
• 2.3 小结25-27
• 第三章 CpG-c41 无刺激性内化机制27-41
• 3.1 材料和方法27-34
• 3.2 结果34-39
• 3.3 小结39-41
• 第四章 探寻 TLR9 信号通路相关 miRNA41-50
• 4.1 材料和方法42-44
• 4.2 结果44-48
• 4.3 小结48-50
• 全文总结50-52
• 参考文献52-58
• 文献综述58-70
• 参考文献64-70
• 攻读学位期间的研究成果70-71
• 致谢71

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本文编号：290524