人胚胎干细胞向功能性肝细胞定向分化方法的优化研究

发布时间：2017-04-07 14:06

  本文关键词：人胚胎干细胞向功能性肝细胞定向分化方法的优化研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：干细胞技术是当今再生医学研究领域最为前沿的科学，特别是人类的胚胎干细胞（embryonic stem cells，简称“ES细胞”），自1998年建系以来，因其优越的分化潜能和高度的自我更新，受到世界范围内研究人员的广泛关注，在临床疾病治疗方面，也具有着优越的应用前景。 ES细胞向成熟功能性肝细胞分化的过程，共分为4个阶段：内胚层的诱导分化阶段、肝特异性细胞的诱导分化阶段、成肝细胞的扩增阶段和肝细胞的成熟阶段。每个阶段都依靠不同的细胞分化因子进行诱导。在本课题中，课题组在细胞分化的起始及扩增阶段，加入了B27作为优化诱导因子。同时，在分化的肝细胞成熟阶段，改变了经典的抑瘤素M（OSM）、地塞米松（Dex）等因子的诱导方式，直接采用HCMTMSingleQuots培养基进行诱导分化。然后，对于分化各个阶段，从形态变化、特异蛋白表达、基因表达等方面进行了检测，特别是对ES细胞衍生的成熟肝细胞进行了功能学评价，从糖原合成、吲哚菁绿代谢能力以及低密度脂蛋白吸收功能三个方面进行了检测，从而全面评价本课题中分化方法在临床治疗方面的可应用性。 研究结果显示：应用本方法可以成功地将人源ES细胞分化为成熟的功能性肝细胞。在分化的终末阶段，细胞呈现典型的肝细胞状态；在内胚层细胞的诱导分化阶段，细胞表达内胚层特异性蛋白FOXA2和SOX17；在成肝细胞的扩增阶段，ES细胞分化的肝细胞，，也具备了一定肝前体细胞的特性，表达AFP和HNF4α；在最后肝细胞成熟阶段，ES细胞分化的成熟肝细胞的特异蛋白ALB和HNF4α均呈阳性表达，而且表达的效率在90%以上。在功能检测方面，研究结果表明：在功能学上，ES细胞分化的成熟功能性肝细胞与真正的人体成熟肝细胞具有较高的一致性。具体来讲，ES细胞分化的肝细胞具有糖原合成和储备的能力。同时，具有代谢吲哚菁绿的能力，以及吸收低密度脂蛋白的功能。更为重要的是，在基因检测方面，与原有的经典实验方法相比，尽管在多能性基因（POU5F1、SOX2和NANOG）的表达调控方面，未见明显的区别。但是，在肝细胞特异性基因（SOX17、HNF4α和ALB）的表达调控方面，本课题的诱导分化方法可以显著提高中后阶段部分肝细胞特异性基因（HNF4α和ALB）的表达水平，从而达到了优化ES细胞向功能性肝细胞定向分化的目的。 总的来讲，本课题以人源ES细胞的肝向分化技术研究为核心，以现有的分化平台为基础，通过细胞分化过程中诱导因子的优化，改善人源ES细胞向成熟功能性肝细胞的分化效率，从而建立一种高效诱导人源ES细胞分化为功能性肝细胞的方法。所以，本课题为肝细胞的发生发育研究和肝脏疾病药物筛选建立了一种新的体外模型，同时，也为人源ES细胞在临床肝脏疾病的治疗应用方面提供一定的理论基础和技术支持。
【关键词】：胚胎干细胞 肝细胞 分化 功能
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 中英文对照表10-11
• 第1章 绪论11-18
• 1.1 ES 细胞技术的诞生11-12
• 1.2 ES 细胞的生物学特性12-13
• 1.3 ES 细胞技术存在的问题13-15
• 1.4 ES 细胞向肝细胞定向分化的诱导方法15-17
• 1.5 实验设计思路17-18
• 第2章 材料与试剂18-23
• 2.1 细胞株18
• 2.2 仪器18-19
• 2.3 试剂19-20
• 2.4 引物序列20-21
• 2.5 培养基的配制21-23
• 第3章 实验部分23-29
• 3.1 ES 细胞的常规培养23-24
• 3.2 ES 细胞向肝细胞的定向分化24
• 3.3 ES 细胞衍生肝细胞的鉴定和评价24-29
• 第4章 实验结果29-37
• 4.1 ES 细胞的形态观察29
• 4.2 ES 细胞在分化过程中的形态学变化29-30
• 4.3 ES 细胞在分化过程中特异蛋白的表达情况30-32
• 4.4 ES 细胞衍生肝细胞的功能性检测结果32-34
• 4.5 ES 细胞定向分化过程中的基因表达变化结果34-37
• 第5章 讨论37-40
• 5.1 本课题分化方法的优势37
• 5.2 ES 细胞与 iPS 细胞在分化方法上的共通性37-38
• 5.3 现阶段 ES 细胞肝向分化方法的存在问题38-40
• 小结40-41
• 参考文献41-44
• 作者简介44-47
• 致谢47

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 李紫聪;黄晓灵;刘德武;吴珍芳;;转基因动物生物反应器研究进展[J];广东畜牧兽医科技;2013年04期

2 常胜合;徐立;李敬阳;孙威;王甲水;许桂莺;孙佩光;吴琼;金志强;舒海燕;;提高香蕉胚性愈伤诱导成功率的可能途径[J];安徽农业科学;2013年19期

3 Min Yao;Jian Chen;Xiao-Xi Yang;Xiao-Ling Zhang;Qing-Shan Ji;Qing Zhou;Jin-Tang Xu;;Differentiation of human amniotic epithelial cells into corneal epithelial-like cells in vitro[J];International Journal of Ophthalmology(English Edition);2013年05期

4 姜英浩;张菊;卢兹凡;;干细胞伦理之争的“终结者”——谈诺贝尔生理学与医学奖获得者山中伸弥[J];医学争鸣;2013年05期

5 徐丽萍;龙大宏;校对;;诱导多能干细胞及其在神经再生医学的应用前景[J];解剖学研究;2013年05期

6 Jian Shu;Hongkui Deng;;Lineage Specifers:New Players in the Induction of Pluripotency[J];Genomics,Proteomics & Bioinformatics;2013年05期

7 Xiao-Bing Zhang;;Cellular Reprogramming of Human Peripheral Blood Cells[J];Genomics,Proteomics & Bioinformatics;2013年05期

8 Wenwen Jia;Wen Chen;Jiuhong Kang;;The Functions of MicroRNAs and Long Non-coding RNAs in Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells[J];Genomics,Proteomics & Bioinformatics;2013年05期

9 Yi-ye Zhou;Fanyi Zeng;;Integration-free Methods for Generating Induced Pluripotent Stem Cells[J];Genomics,Proteomics & Bioinformatics;2013年05期

10 Menghua Wu;Guilai Chen;Baoyang Hu;;Induced Pluripotency for Translational Research[J];Genomics,Proteomics & Bioinformatics;2013年05期

中国重要会议论文全文数据库 前2条

1 周灿权;李宇彬;;研究中的生殖医学技术[A];中华医学会生殖医学分会第二次全国生殖临床学术研讨会论文汇编[C];2012年

2 张可华;袁宝珠;;治疗性干细胞产品相关的风险因素[A];2012年中国药学大会暨第十二届中国药师周论文集[C];2012年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 贾蓓;A型血友病人非整合诱导多能干细胞建系及其细胞疾病模型的建立[D];南方医科大学;2012年

2 申晶;骨髓源间充质干细胞输注促进STZ诱导的糖尿病大鼠胰腺内α细胞向β细胞的转变：糖尿病治疗的新模式[D];中国人民解放军军医进修学院;2013年

3 朱玉德;胶质瘤干细胞的生物学特性及其与胶质瘤血管发生的关系[D];苏州大学;2013年

4 丛义梅;猪原始生殖细胞体内跟踪、体外培养及遗传印记的研究[D];东北农业大学;2013年

5 陈雪梅;人胚胎干细胞传代培养和神经诱导分化过程中基因组遗传变异的动态变化[D];郑州大学;2013年

6 李远;杂合型重编程Oct4联合多能干细胞因子表现重编程人脑胶质瘤细胞的研究[D];郑州大学;2013年

7 靳木子;阿尔巴斯白绒山羊与绵羊胚胎干细胞培养技术的研究[D];内蒙古大学;2013年

8 袁建龙;利用体细胞核移植技术生产转基因绒山羊的研究[D];内蒙古大学;2013年

9 梅宇钦;黄酮类化合物库内小分子4a经由PPAR-β-Mfn2-[Ca~(2+)]_M信号调控胚胎干细胞神经分化[D];浙江大学;2013年

10 杨梅;NAIF1基因在胃癌细胞中的功能与机理研究[D];北京协和医学院;2013年

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1 王振;造血系统关键转录因子的慢病毒载体构建及表达[D];山东师范大学;2013年

2 陈明;骨髓单个核细胞在脑缺血大鼠脑内受损区域的定向分化[D];郑州大学;2013年

3 孙博;人废弃胚胎群体培养及胚胎干细胞系的建立[D];郑州大学;2013年

4 费璇;KLF4在大鼠晶状体损伤促进视神经再生过程中的表达[D];郑州大学;2013年

5 雷学华;重编程因子对小鼠组蛋白H3K4/27甲基化酶基因启动子活性的影响[D];安徽大学;2013年

6 邓玉金;应用小鼠ESCs体外诱导己分化体细胞为iPSCs的异性来源鉴别体系研究[D];西南大学;2013年

7 赵龙彪;乌司他丁对急性心肌梗死大鼠心脏的保护作用[D];河北医科大学;2013年

8 曹玲玲;Hemin诱导K562细胞向红系细胞分化和胞质杂交体的蛋白质组学及NPM1功能的初步研究[D];浙江理工大学;2013年

9 孟泳圳;卵巢上皮癌侧群细胞（side population,Sp）研究[D];广西医科大学;2013年

10 郝向伟;家蚕Hedgehog信号通路相关基因的克隆、鉴定及其功能分析[D];西南大学;2013年

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本文编号：290590