GGTA1/β4GalNT2双基因敲除的巴马小型猪PFFs细胞系的建立

发布时间：2020-12-12 13:02

　　目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立巴马小型猪胚胎成纤维细胞（porcine fetal fibroblasts, PFFs）α-1,3-半乳糖基转移酶（α-1, 3-galactosyltransferase,GGTA1）/β-1,4 N-乙酸氨基半乳糖转移酶（β-1,4 N-acetylgalactosaminyltransferase,β4GalNT2）双基因敲除细胞系,为构建α-1,3-半乳糖（α-1,3-galactose,α-Gal）和SD（a）抗原缺失的巴马小型猪模型奠定基础。方法分别选取猪GGTA1基因的第三外显子和β4GalNT2基因的第八外显子为敲除靶点,利用在线工具（http://crispr.mit.edu）设计并合成单导向RNA（single guide RNA,sgRNA）,以含有Cas9基因的pX330质粒为骨架构建打靶载体,转染野生巴马小型猪的PFFs,用T7EN1酶切验证打靶载体敲除效率。将打靶载体与G418抗性质粒（tdTomato）共转染巴马小型猪PFFs,经药物筛选获得阳性单细胞克隆后测序鉴定基因型。结果成功构建靶向GGTA1和β4Ga... 

【文章来源】：实用器官移植电子杂志. 2019年04期 第277-282页

【文章页数】：6 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 实验材料：
    1.2 实验方法
        1.2.1 构建质粒：
        1.2.3 克隆细胞筛选与鉴定：
        1.2.4 T7EN1酶切检测突变效率：
        1.2.5 体细胞克隆：
        1.2.6 获得双基因双敲的巴马小型猪：
        1.2.7
2 结果
    2.1 GGTA1/β4GalNT2基因CRISPR/Cas9靶向载体的构建：
    2.2 T7EN1酶酶切实验验证sgRNAs敲除效率：
    2.3单细胞克隆的获得和鉴定：
3 讨论


【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR/Cas9介导的β4GalNT2基因敲除猪制备[J]. 唐雨婷,高景波,龙川,杜敏杰,黄林华,潘登科,杜晓华.  农业生物技术学报. 2017(10)
[2]基因修饰猪作为异种器官移植供体的研究进展[J]. 李文玲,鲍磊,肖磊.  中国细胞生物学学报. 2014(09)
[3]巴马小型猪在医学研究中的应用进展[J]. 庞琳琳,张会永,杨关林.  中国实验动物学报. 2014(01)
[4]利用体细胞LOH突变制备α1,3-半乳糖基转移酶基因（GGTA1）缺失的五指山小型猪[J]. 王飞,冯冲,龙川,岳成鹤,王宁,李西睿,曹随忠,李明洲,储明星,潘登科,帅素容.  畜牧兽医学报. 2013(04)
[5]利用启动子缺陷型打靶载体敲除五指山小型猪GGTA1基因[J]. 郑道山,冯冲,朱彦宾,龙川,冯书堂,潘登科,马文丽.  生物技术通讯. 2011(04)

博士论文
[1]利用CRISPR/Cas9技术构建C3基因敲除猪模型和稳定表达红色荧光蛋白的人胚胎干细胞系的建立[D]. 张纬.南京医科大学 2017

硕士论文
[1]利用CRISPR/Cas9技术构建ApoE-/-猪模型[D]. 袁益琳.南京医科大学 2016



本文编号：2912610