Calpain-2对阿霉素心肌毒性干预作用的研究及ragB-mGITRL DNA疫苗的研制

发布时间：2020-12-20 08:18

　　心肌损伤可由病毒、细菌等感染,导致的心肌炎或化学药物的毒性作用等多种因素所介导,严重影响人类的健康。本论文涉及对阿霉素和牙龈卟啉菌两类心脏毒性诱因的十预性研究,旨在趋利避害,从源头上预防两类因素对心脏造成的病理性损伤。阿霉素,是一种作用于DNA的葸环类抗生素,广泛应用于临床抗肿瘤的药物。阿霉素的应用带来多方面的副作用,包括恶心、呕吐和心律不齐等。其中当累积剂量达至（?）55mg/m2（?）（?）,能够引起充血性心衰、扩张性心肌病甚至死亡,从而限制了其临床应用。迄今为止,阿霉素的急性和累积性心脏毒性的机制尚未完全清楚,更无预防和治疗阿霉素诱导心肌病行之有效的措施。Calpain,即钙蛋白酶,属于钙离子依赖的半胱氨酸蛋白酶家族,广泛表达于哺乳动物以及多种其他生物。人类已鉴定的15种亚型的分布、结构和功能均有明显差异。其中“-calpain（calpain-1）和m-calpain（calpain-2）为普遍存在且研究深入。Calpain的激活参与机体多系统疾病,如糖尿病、阿尔滋海默氏病、动脉粥样硬化以及胃癌等。前期研究发现,calpastatin的过表达,加剧了阿霉素引起的急性心肌毒性,表... 

【文章来源】：江苏大学江苏省

【文章页数】：145 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 Calpain
        1.1.1 概述
        1.1.2 Calpain超家族的结构
            1.1.2.1 经典calpain的结构
            1.1.2.2 非经典calpain的结构
            1.1.2.3 Calpastatin的结构
        1.1.3 Calpain的功能
        1.1.4 Calpain与疾病的关系
    1.2 阿霉素
        1.2.1 概述
        1.2.2 阿霉素引起心肌毒性的机制
    1.3 Tet系统
        1.3.1 概述
        1.3.2 Tet-Off和Tet-On系统
    1.4 牙龈卟啉菌
        1.4.1 概述
        1.4.2 牙龈卟啉菌与牙周炎及系统性疾病的关系
    1.5 DNA疫苗
        1.5.1 概述
        1.5.2 DNA疫苗的作用机制
        1.5.3 DNA疫苗的佐剂
        1.5.4 DNA疫苗的应用
    1.6 本研究的目的、试验方案的设计及意义
        1.6.1 研究的目的
        1.6.2 研究的技术路线
            1.6.2.1 体外研究calpain-2在阿霉素诱导的心肌细胞毒性中的作用
            1.6.2.2 体内研究calpain-2在阿霉素诱导的心肌细胞毒性中的作用
            1.6.2.3 ragB/mGITRL DNA疫苗的构建
            1.6.2.4 体内研究DNA疫苗在牙龈卟啉菌感染中的作用
        1.6.3 研究的意义
第二章 Calpain-2转基因小鼠系统的建立
    2.1 实验仪器和材料
        2.1.1 实验仪器
        2.1.2 实验材料
        2.1.3 实验试剂
        2.1.4 实验动物
    2.2 实验方法
        2.2.1 Calpain-2转移基因小鼠系统的构建
        2.2.2 PCR法鉴定转基因小鼠基因型
        2.2.3 Western blot法检测心肌组织中calpain-1和calpain-2的表达
        2.2.4 酶谱法测定心肌中calpain的活性
        2.2.5 心脏超声法检测模型小鼠的心功能
        2.2.6 统计分析
    2.3 结果
        2.3.1 建立Calpain-2转基因小鼠系统
        2.3.2 Calpain-2转基因小鼠基因型的鉴定
        2.3.3 Calpain-2在转基因小鼠心肌中特异性过表达
        2.3.4 Calpain-2在心肌中过表达未影响小鼠心脏功能
    2.4 讨论
第三章 Calpain-2在阿霉素诱导的心肌细胞凋亡中的作用
    3.1 实验仪器和材料
        3.1.1 实验仪器
        3.1.2 实验材料
        3.1.3 实验试剂
        3.1.4 实验动物
    3.2 实验方法
        3.2.1 原代新生小鼠心肌细胞的分离培养
        3.2.2 原代心肌细胞感染腺病毒及感染效率
        3.2.3 细胞原位calpain活性的测定
        3.2.4 心肌细胞的半胱门冬氨酸蛋白酶Caspase-3活性测定
        3.2.5 DNA片段化酶联免疫吸附实验（ELISA）检测心肌细胞凋亡
        3.2.6 实时定量PCR检测原代心肌细胞中AKT mRNA水平
    3.3 结果
        3.3.1 阿霉素降低心肌细胞中calpain的活性
        3.3.2 Calpain-2过表达改善阿霉素引起的心肌细胞调亡
        3.3.3 药理性和内源性calpain抑制剂促进阿霉素引起的心肌细胞调亡
        3.3.4 AKT参与calpain-2对阿霉素引起的心肌细胞凋亡的保护作用
    3.4 讨论
第四章 Calpain-2在阿霉素诱导的小鼠心肌毒性模型中的作用及机制研究
    4.1 Calpain-2在阿霉素诱导的小鼠急性心肌毒性模型中的作用
        4.1.1 实验仪器和材料
            4.1.1.1 实验仪器
            4.1.1.2 实验材料
            4.1.1.3 实验试剂
            4.1.1.4 实验动物
        4.1.2 实验方法
            4.1.2.1 建立阿霉素急性心脏毒性模型
            4.1.2.2 小鼠心肌组织的半胱门冬氨酸蛋白酶Caspase-3活性测定
            4.1.2.3 实时定量PCR检测心肌组织中AKT mRNA水平
            4.1.2.4 Western blot法检测AKT磷酸化水平
            4.1.2.5 心脏超声法检测模型小鼠的心功能
            4.1.2.6 统计学分析
        4.1.3 结果
            4.1.3.1 Calpain-2过表达改善阿霉素引起的心功能降低
            4.1.3.2 Calpain-2过表达逆转阿霉素引起的心肌细胞凋亡
            4.1.3.3 AKT参与calpain-2对阿霉素引起心肌毒性的保护作用
    4.2 Calpain-2在阿霉素诱导的小鼠慢性心肌毒性模型中的作用
        4.2.1 实验仪器和材料
            4.2.1.1 实验仪器
            4.2.1.2 实验材料
            4.2.1.3 实验试剂
            4.2.1.4 实验动物
        4.2.2 实验方法
            4.2.2.1 建立阿霉素慢性心脏毒性模型
            4.2.2.2 小鼠心脏组织石蜡包埋
            4.2.2.3 心肌组织切片WGA染色
            4.2.2.4 心肌组织的半胱门冬氨酸蛋白酶（Caspase-3）活性测定
            4.2.2.5 心脏超声法检测模型小鼠的心功能
            4.2.2.6 统计学分析
        4.2.3 结果
            4.2.3.1 Calpain-2过表达改善阿霉素诱导的慢性心肌毒性小鼠的心功能
            4.2.3.2 Calpain-2过表达逆转阿霉素引起的慢性心脏毒性中心肌细胞的凋亡
            4.2.3.3 Calpain-2过表达改善阿霉素引起的心肌细胞肥大
            4.2.3.4 Calpain-2过表达提高阿霉素引起的慢性心脏毒性模型鼠的生存率
    4.3 讨论
第五章 外膜蛋白ragB与GITRL真核共表达载体的构建及表达
    5.1 实验仪器和材料
        5.1.1 实验仪器
        5.1.2 实验材料
        5.1.3 实验试剂
    5.2 方法
        5.2.1 PCR引物及其设计
        5.2.2 ragB基因的克隆
        5.2.3 重组质粒pIRES-ragB、pIRES-ragB-mGITRL的构建与鉴定
        5.2.4 重组质粒pIRES-ragB-mGITRL的表达鉴定
    5.3 结果
        5.3.1 牙龈卟啉菌外膜蛋白ragB基因的PCR扩增
        5.3.2 重组质粒pIRES-ragB及pIRES-ragB-mGITRL的构建及鉴定
        5.3.3 重组质粒pIRES-ragB-mGITRL在体外和体内的表达
    5.4 讨论
第六章 GITRL增强ragB DNA疫苗对抗牙龈卟啉菌感染的保护及其机制研究
    6.1 实验仪器和材料
        6.1.1 实验仪器
        6.1.2 实验材料
        6.1.3 实验试剂
        6.1.4 实验动物
    6.2 方法
        6.2.1 牙龈卟啉菌的培养
        6.2.2 质粒免疫小鼠
        6.2.3 ELISPOT法检测脾脏和骨髓中特异性抗体形成细胞
        6.2.4 实时定量PCR法检测脾细胞中细胞因子的含量
        6.2.5 ELISA法检测小鼠血清中细胞因子的含量
        6.2.6 流式细胞术分析脾脏中Tfh和IFN-γ+T细胞的含量
        6.2.7 小鼠溃疡模型的诱导
        6.2.8 统计学分析
    6.3 结果
        6.3.1 牙龈卟啉菌W83菌株的鉴定
        6.3.2 GITRL上调RagB特异性抗体和抗体形成细胞的数量
+T细胞的增殖">        6.3.3 携带mGITRL的ragB疫苗促进Tfh和IFN-γ⁺T细胞的增殖
        6.3.4 携带mGITRL的ragB疫苗提高IL-21和IFN-γ的表达
        6.3.5 DNA疫苗对牙龈卟啉菌攻击性溃疡形成的影响
    6.4 讨论
第七章 全文结论与展望
    7.1 全文结论
    7.2 主要创新点
    7.3 展望
参考文献
攻读学位期间发表和待发表的论文
在读期间主持及参与的科研项目
在读期间参加的主要学术会议
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]慢性牙周炎状态下牙龈卟啉单胞菌rag-1基因的表达变化[J]. 汪贯华,张冬梅,潘亚萍.  上海口腔医学. 2009(03)



本文编号：2927541