MHC-I类似分子在中枢神经系统中表达的初步研究

发布时间：2017-04-08 14:26

  本文关键词：MHC-I类似分子在中枢神经系统中表达的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex, MHC)在免疫系统中的作用已经得到了广泛的研究。其中的MHC-I分子表达于全身所有有核细胞的表面，在免疫细胞的发育、抗原识别和T细胞免疫应答等方面起着重要的作用。此外，MHC-I还与NK细胞（natrural killer cell）的抑制性受体结合，抑制NK细胞对表达自身MHC-I分子的细胞的杀伤作用。另一方面，对于NK细胞而言，除了抑制性受体外，它们还表达一些激活性受体，其中的NKG2D可以被一些MHC-I类似分子激活，从而拮抗MHC-I对NK细胞的抑制作用。 目前已发现的NKG2D的配体(NKG2D ligand, NKG2DL)都是MHC-I的类似分子，鼠类包括三个家族：Rae-1（α, β, γ, δ和ε），Mult1和H60(a, bc)；人类包括两个家族：MIC (A、B)和ULBP (1-6)。借由NKG2D受体，这些MHC-I类似分子在NK细胞中起着与MHC-I相反的作用，即对NK细胞的激活作用。这些MHC-I类似分子通常只在有问题的细胞，如转化、病毒感染和有DNA损伤的细胞中表达。通过表达MHC-I类似分子(NKG2DL)，进而NKG2D受体激活NK细胞，使这些有问题的细胞得以清除。因此，MHC-I类似分子和NK细胞的NKG2D一起，形成一道防止有问题细胞在体内存活的天然屏障。 MHC-I及其类似分子是否只在免疫系统中发挥作用呢？对MHC-I的研究表明，它在神经系统中同样起着关键作用。MHC-I广泛表达在胚胎、新生及成年小鼠及人脑中，其在神经元中的表达具有时空特异性和可调节性。进一步的研究发现，MHC-I对神经功能的可塑性也起着重要作用。多种MHC-I的受体如Ly49等也在神经元中表达。 那是否MHC-I类似分子的作用就只局限于免疫系统呢？实际上Rae-1在体内的表达最初是在胚胎鼠的前脑中发现的，它的表达伴随着胚胎神经发育的关键时期（E13-E18），且Rae-1家族成员的表达有时空和量的差别。这之后意外发现其作为NKG2D的配体在免疫系统中的作用，而使Rae-1在神经系统和神经发育过程中可能作用的研究被忽略了，只有极少对于Rae-1的研究涉及神经领域。鉴于已发现MHC-I分子在神经中的表达及重要作用，以及多种神经与免疫系统间的相似性，我们有理由相信MHC-I类似分子同样在神经系统中发挥作用。 为了研究Rae-1等MHC-I类似分子在小鼠中枢神经系统中的可能作用，本课题的主要目标是系统研究这些分子及其受体在胚胎发育及成年中枢神经系统的表达及其蛋白的定位，包括利用RT-PCR和原位分子杂交分析这些基因的表达，免疫组织化学分析这些蛋白在中枢神经的分布，以及免疫荧光标记确定Rae-1蛋白在神经细胞亚细胞结构上的定位。首先通过对Rae-1五种亚型的比对和引物设计方法，设计出能扩增全部Rae-1成员和Mult1、H60的三个成员、以及NKG2D的引物，利用RT-PCR分析这些基因的表达。结果发现除H60外，这些基因全部在胚胎及成年中枢神经系统有较高表达；此外，定量RT-PCR实验的结果表明，胚胎10-18天小鼠的胚胎脑中这些基因的表达最高，出生前表达显著降低，，但在成年脑中仍维持低水平表达。以上结果表明，与MHC-I分子一样，MHC-I类似分子也都在发育中及成年后的中枢神经系统表达；此外，以上结果首次发现NK细胞的NKG2D受体在神经系统有高度表达。为了对这些分子在中枢神经的表达进行定位，本研究还构建了原位分子杂交用的探针，并进行了初步的原位分子杂交实验，以及初步的Western blot和免疫组织化学染色实验。另外，为了确定Rae-1蛋白在神经细胞的亚细胞结构上的分布，本研究在胚胎中提取了Rae-1RNA，逆转录后构建全长的真核表达质粒，以及带FLAG标签的Rae-1表达质粒，并在Neuro2a细胞中进行了表达。以上实验为进一步研究MHC-I类似分子及其受体在中枢神经发育及正常功能中的作用打下了基础。
【关键词】：主要组织相容性复合体 NKG2D配体 Rae-1 Mult1 H60 基因表达
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R338
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-13
• 第1章 前言13-21
• 1.1 MHC- I简介13-16
• 1.1.1 MHC -I在免疫系统中的作用14-15
• 1.1.2 神经系统中的作用15-16
• 1.2 NKG2D 及其配体16-21
• 1.2.1 NK 细胞的激活受体——NKG2D16-17
• 1.2.2 NKG2D 的配体——Rae-1，Mult1 和 H6017-21
• 第2章 带有 FLAG 标签的 RAE-1 表达载体的构建21-40
• 2.1 序言21-23
• 2.1.1 标签的种类和应用21-22
• 2.1.2 重叠 PCR的原理22-23
• 2.2 材料及试剂23-25
• 2.3 实验流程25-34
• 2.3.1 提取 RNA25-26
• 2.3.2 合成鼠胚 1st-cDNA26-27
• 2.3.3 RT-PCR27-28
• 2.3.4 琼脂糖凝胶 DNA 回收28
• 2.3.5 Rae-1基因与载体连接并转化28-29
• 2.3.6 阳性重组子的鉴定29
• 2.3.7 Overlap PCR29-32
• 2.3.8 双酶切和表达载体连接32-34
• 2.4 讨论34-39
• 2.5 本章结论39-40
• 第3章 ICR 小鼠中 RAE-1 亚型的表达40-44
• 3.1 序言40-41
• 3.1.1 引物的设计原则40-41
• 3.1.2 ICR 型小鼠41
• 3.2 材料与试剂41
• 3.3 实验方法41-43
• 3.3.1 序列比对41-43
• 3.3.2 测序43
• 3.4 结果和讨论43
• 3.5 本章结论43-44
• 第4章 MHC-Ⅰ类似分子和 NKG2D 在 ICR 鼠及细胞系的表达情况44-54
• 4.1 序言44
• 4.2 实验材料44-46
• 4.2.1 材料44-45
• 4.2.2 试剂45
• 4.2.3 器材45
• 4.2.4 培养基配制45-46
• 4.3 实验方法46-49
• 4.3.1 小鼠的饲养与繁殖46-47
• 4.3.2 细胞培养47-48
• 4.3.4 成年鼠的灌流取脑48
• 4.3.5 胚鼠脑 RNA提取及组织包埋48-49
• 4.3.6 T-A克隆与测序49
• 4.4 结果和讨论49-53
• 4.4.1 Rae-1在胚胎鼠脑，成年鼠脑及细胞系中的表达情况50
• 4.4.2 Mult1在胚胎鼠脑，成年鼠脑及细胞系中的表达情况50-51
• 4.4.3 H60在胚胎鼠脑，成年鼠脑及细胞系中的表达情况51-52
• 4.4.4 NKG2D52-53
• 4.5 本章结论53-54
• 第5章 RAE-1 在胚鼠脑中的表达变化54-62
• 5.1 实时荧光定量 PCR原理54-57
• 5.1.1 常用的荧光定量 PCR技术54-56
• 5.1.2 实时定量 PCR的相对定量方法56-57
• 5.2 实验材料57
• 5.3 实验方法57-59
• 5.3.1 提取组织 RNA57-58
• 5.3.2 合成 1st-cDNA58
• 5.3.3 实时荧光相对定量 PCR（qPCR）58-59
• 5.4 结果与讨论59-61
• 5.4.1 qPCR引物检测59-60
• 5.4.2 结果分析60-61
• 5.5 本章结论61-62
• 第6章 原位分子杂交方法检测 RAE-1 在胚胎中的表达位置62-70
• 6.1 序言62-63
• 6.1.1 原位分子杂交原理62
• 6.1.2 RNA探针的原理和特点62-63
• 6.2 材料与试剂63-64
• 6.3 实验方法64-67
• 6.3.1 制作 RNA探针64-65
• 6.3.2 制作冰冻切片65-66
• 6.3.3 杂交66-67
• 6.4 结果与讨论67-70
• 第7章 RAE-1 在神经细胞中的表达位置70-74
• 7.1 序言70-72
• 7.1.1 免疫荧光原理70-71
• 7.1.2 细胞转染71
• 7.1.3 N-2a 细胞的诱导分化71-72
• 7.2 实验材料72
• 7.3 试验方法72
• 7.3.1 细胞转染72
• 7.3.2 G418筛选72
• 7.4 结果与讨论72-74
• 第8章 结论74-76
• 参考文献76-84
• 作者简介84-85
• 致谢85

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