不同狂犬疫苗免疫后血清交叉保护作用研究

发布时间：2017-04-08 15:14

  本文关键词：不同狂犬疫苗免疫后血清交叉保护作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：狂犬病是一种由狂犬病毒引起的致死性疾病，，注射狂犬病疫苗是预防发病的重要手段。我国存在多种狂犬病毒流行株，这就要求疫苗能刺激机体产生对不同流行株具有交叉保护的广谱中和抗体。目前对我国市售的狂犬病疫苗的广谱保护性的研究较少，因此本研究将进行动物实验检测这些狂犬疫苗对不同株病毒的保护性。此外，研究表明多种包膜病毒（如HIV-1，流感病毒，丙型肝炎病毒）膜蛋白的糖基化会使病毒逃避抗体的中和作用，而狂犬病毒包膜蛋白G蛋白这方面的研究比较少，本研究也将探索狂犬病毒G蛋白的糖基化对病毒感染能力和抗体中和作用的影响。 方法：本研究使用假病毒系统对我国狂犬疫苗的广谱保护性进行验证。选用四种不同株病毒制备的狂犬病疫苗对balb/c小鼠进行分组免疫并收获血清。制备几种具有HIV-1核衣壳和狂犬病毒G蛋白的假病毒，该假病毒携带荧光素酶报告基因，具有单轮感染能力，感染细胞可以表达荧光素酶。将假病毒与免疫血清共孵育后感染BHK-21细胞，根据荧光素酶表达量确定免疫血清对不同株狂犬假病毒中和能力。另一方面，通过定点突变的方法增加或减少病毒G蛋白上的糖基化位点，检测突变株病毒的感染能力以及免疫血清对病毒的中和能力。 结果：成功包装了能够感染BHK-21细胞并表达荧光素酶的CVS-11株、CTN株、aG株假病毒，免疫了不同狂犬疫苗的小鼠体内产生的抗体对上述假病毒均具有中和能力。病毒G蛋白204位和247位氨基酸的糖基化对病毒的感染能力产生一定影响，单独增加204位糖基化使病毒感染能力增强，单独去除247位糖基化位点使病毒感染能力降低，同时进行上述两种变化则病毒感染能力下降。但改变上述糖基化位点，免疫血清对病毒的中和能力没有改变。 结论：本研究证明了我国狂犬病疫苗免疫后血清对不同流行株具有中和能力，说明市售的四种狂犬疫苗能产生广谱中和抗体。狂犬病毒G蛋白204位和247位糖基化位点对病毒的感染能力具有一定的影响，但不能使病毒逃避抗体的中和作用，说明尽管不同毒株的抗原性和糖基化有所差异，但不影响中和抗体对这些病毒的中和能力。本研究中采用的假病毒检测方法还可以对其他狂犬病疫苗的适用性和质量进行评价。
【关键词】：狂犬病毒 疫苗 交叉保护 G蛋白糖基化 假病毒
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 缩略语表11-12
• 第1章 前言12-26
• 1.1 狂犬病介绍12-24
• 1.1.1 狂犬病毒形态特征14-15
• 1.1.2 狂犬病毒基因组结构15
• 1.1.3 狂犬病毒的蛋白结构15-16
• 1.1.4 狂犬病毒的 G 蛋白16-19
• 1.1.5 狂犬病毒的生活周期19-20
• 1.1.6 病毒分型20-22
• 1.1.7 我国狂犬病流行病学22
• 1.1.8 狂犬病毒疫苗22-23
• 1.1.9 狂犬病毒中和抗体检测方法23-24
• 1.2 本文的研究目的和设计思路24-26
• 第2章 实验方法26-39
• 2.1 试剂和材料26-28
• 2.1.1 质粒菌株细胞26
• 2.1.2 主要仪器26-27
• 2.1.3 主要试剂27
• 2.1.4 溶液配制27-28
• 2.1.5 引物及测序28
• 2.2 实验方法28-39
• 2.2.1 动物免疫方案28-29
• 2.2.2 获得目的基因所需引物设计29
• 2.2.3 提取总 RNA29-30
• 2.2.4 目的基因的扩增30-32
• 2.2.5 片段连接、质粒转化及小提、测序鉴定32-33
• 2.2.6 片段与真核表达载体连接并克隆33
• 2.2.7 假病毒包装33-34
• 2.2.8 Western-Blot34
• 2.2.9 假病毒滴度的测定34-35
• 2.2.10 中和抗体检测35-36
• 2.2.11 构建突变病毒质粒36-39
• 第3章 实验结果39-51
• 3.1 质粒构建39-40
• 3.1.1 目的基因的扩增39
• 3.1.2 表达质粒的构建39-40
• 3.2 假病毒包装40-41
• 3.3 假病毒感染性检测41-42
• 3.3.1 带有 GFP 报告基因的假病毒41-42
• 3.3.2 带有 Luc 报告基因的假病毒42
• 3.4 假病毒中和抗体检测42-43
• 3.5 小鼠血清对病毒的中和活性43-45
• 3.6 G 蛋白基因改造45-51
• 3.6.1 定点突变及 overlap PCR45-49
• 3.6.2 突变病毒感染性检测49-51
• 第4章 讨论51-54
• 第5章 结论与创新点54-55
• 参考文献55-60
• 致谢60-61
• 作者简介61

【共引文献】

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本文编号：293124