抗安丝菌素单抗的制备及其ELISA检测方法的建立

发布时间：2017-04-08 19:37

  本文关键词：抗安丝菌素单抗的制备及其ELISA检测方法的建立，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：抗体药物偶联物（Antibody-drug conjugate）是一类正在进行临床研究的、用于治疗癌症的日益重要的新型的靶向性药物。在开发这类药物的过程中，在研究药物在体内体外的稳定性、药物在体内代谢的情况时，我们需要精确的测定小分子药物从抗体上脱落的比例、偶联上的小分子和抗体的摩尔比值变化、血液中脱落的小分子药物的浓度。ELISA(酶联免疫分析法enzyme-linked immunosorbent assay)检测方法相对同位素标记法、LC-MS等检测方法具有经济、快速、便捷等优势，而小分子药物人工抗原和抗体的研制是建立酶联免疫快速检测的关键。鉴于此，本论文开展了以下研究： 设计合成了2种安丝菌素（Ansamitocin）衍生物DM1抗原,一种免疫抗原KLH-MCC-DM1，一种包被抗原trastuzumab-2A-DM1；通过测定抗体偶联前后在波长252nm吸光值的变化，测定DM1偶联到载体蛋白的情况。结果表明二种偶联方式都成功将DM1偶联到载体蛋白。 将制备的免疫抗原免疫BALB/C小鼠以制备抗DM1单克隆抗体，经过多轮ELISA筛选，获得1株可稳定分泌抗DM1单克隆抗体的母克隆，经过三轮亚克隆，获得稳定的杂交瘤细胞。制备腹水并进行了免疫特性分析。结果表明该杂交瘤细胞株分泌的抗体亚类为IgG1，轻链为lambda型。 利用获得的单克隆抗体建立了DM1和抗体的ELISA检测方法。ELISA检测方法学验证结果表明Trastuzumab-2A-DM1抗体部分的检测不受bFGF、EGF、VEGF、TNF-α的干扰；高、中、低三个浓度样品的平均回收率在85～95%之间，精密度小于10%；定量下限1.95ng/ml的准确度为93.95%，精密度为5.5%；板内和板间的准确度都在80～100%范围内，，精密度15%。最后测定了trastuzumab-2A-DM1在大鼠体内的代谢。
【关键词】：安丝菌素 单克隆抗体 抗体药物偶联物 酶联免疫分析
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-9
• 第一章 绪论9-18
• 1.1 本课题的立题背景9-10
• 1.2 抗体药物偶联物概述10-14
• 1.3 用免疫测定法分析抗体药物偶联物14-16
• 1.3.1 总抗体的 ELISA 检测14-15
• 1.3.2 半均匀 ELISA 法15
• 1.3.3 竞争 ELISA 法15
• 1.3.4 用免疫测定法分析抗体药物偶联物面临的挑战15-16
• 1.4 本论文的研究目标及技术路线16-18
• 第二章 DM1 抗原设计、合成及鉴定18-23
• 2.1 引言18
• 2.2 材料与方法18-20
• 2.2.1 药品与试剂18
• 2.2.2 主要仪器及设备18-19
• 2.2.3 试验方法19-20
• 2.4 结果与分析20-21
• 2.4.1 免疫原 KLH-MCC-DM1 的鉴定20-21
• 2.4.2 检测抗原 Trastuzumab-2A-DM1 的鉴定21
• 2.5 本章小结21-23
• 第三章 抗 DM1 单克隆抗体的制备与鉴定23-35
• 3.1 引言23
• 3.2 材料与方法23-29
• 3.2.1 药品与试剂23
• 3.2.2 实验动物和细胞23
• 3.2.3 主要仪器与设备23-24
• 3.2.4 实验方法24-29
• 3.3 结果与分析29-34
• 3.3.1 免疫小鼠血清筛选29
• 3.3.2 杂交瘤细胞株的建立29-30
• 3.3.3 单克隆抗体的纯化30-32
• 3.3.4 单克隆抗体特性鉴定32-33
• 3.3.5 ELISA 检测方法的建立及 Trastuzumab-2A-DM1 在体外全血中的稳定性33-34
• 3.4 本章小结34-35
• 第四章 ELISA 检测方法测定 TRASTUZUMAB-2A-DM1 在大鼠体内的代谢研究35-42
• 4.1 前言35
• 4.2 材料和仪器35-36
• 4.2.1 药品与试剂35
• 4.2.2 实验动物35-36
• 4.2.3 主要仪器及设备36
• 4.3 实验方法36-39
• 4.3.1 制作标准曲线 ELISA 方法（见第三章 3.2.4.7）36
• 4.3.2 测定方法的验证（ELISA 方法见第三章 3.2.4.7）36-38
• 4.3.3 实际样品的测定（Trastuzumab-2A-DM1 稳定性研究）38-39
• 4.4 结果与分析39-41
• 4.4.1 偶联物抗体部分的标准曲线39
• 4.4.2 偶联物 DM1 部分的标准曲线39-40
• 4.4.3 实际样品的测定（Trastuzumab-2A-DM1 的稳定性研究）40-41
• 4.5 本章小结41-42
• 结论与展望42-43
• 参考文献43-46
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果46-47
• 致谢47-48
• 答辩委员会对论文的评定意见48

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