利用复制干扰突变构建具有抗HBV作用的显性阴性突变体研究

发布时间：2020-12-24 04:14

　　目的 慢性HBV感染是我国的常见病，迄今尚无满意疗法。基因治疗是抗病毒治疗研究的热点，获得高效靶向性导入载体是基因治疗的关键。HBV具有天然嗜肝特性，能在肝细胞内持续复制，反复感染，病毒本身对细胞无明显细胞毒性。HBV具有作为肝靶向性基因治疗载体的基本条件，与其它病毒载体相比，理论上具有明显优势：它可以利用乙肝患者这个天然“包装细胞”，将目的基因的嗜肝性及抗HBV作用在慢性HBV感染者体内长期保持及放大；当HBV复制水平下降时，重组HBV也将随之减少或消失，有可能从根本上克服目前治疗载体的缺陷。本课题对HBV基因组作了三种类型改造：（1）构建C基因截短型HBV载体；（2）构建包膜蛋白突变的HBV载体；（3）构建核心蛋白和包膜蛋白联合突变HBV载体，在细胞和分子水平上观察它们的抗HBV作用，同时探讨adw亚型C基因截短型HBV载体在ayw亚型缺失包装信号辅助质粒辅助下的复制和包装。 方法 1、以野生型HBV质粒adwR9为骨架，构建C基因截短型、野生型C基因真核表达载体pcDNA3-△C（缺失核心蛋白的118-183aa）、pcDNA3-C和C基因截短型HBV载体pHBV-△C（缺... 

【文章来源】：中国人民解放军陆军军医大学重庆市

【文章页数】：104 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

图I一9荧光定量检测转染细胞上清和

、、800bn图11一spHBV一msl、pHBV一ms酶切鉴定图11一gpHBV一msls酶切鉴定lanel:adwRg，laneZ:PHBV一msllane3:PHBV一ms1Inel，2，3:PHBV一ms15lane4:marker2.重组单基因S突变体抗HBV作用2.1重组载体蛋白表达分别将adwRg、peDNA3一ms和peDNA3一3瞬时转染HepGZ细胞，48小时后提取胞内蛋白，采用Westernblot检测蛋白表达情况。突变S蛋白的大小和野生型S蛋白一致，分子量约为27KD，见图11一10

11一15荧光定量PCR检测胞内病毒量图:2.279E+073:8.573E+08adwRg(胞内)2:1.893E斗08pHBV一msl(胞内)pHBV一ms(胞内)4:9.463E+09pHBV一ms1s(胞内)3presl、S基因联合突变HBV突变体抗HBV作用将pHBV一ms15与adwRg共转染HepGZ细胞，以peDNA3和adwRg染HepGZ细胞为对照。48小时后提取培养上清和胞内病毒颗粒，采定量PCR检测病毒量，结果见图H一16，突变体与adwRg共转染组胞量较对照组明显增多，培养上清中病毒量较对照组少，提示包膜突变正常包膜蛋白相互作用，干扰成熟病毒颗粒分泌和包装。月l·ooE刁。9的Q.尸叫1.00E-田7__________

【参考文献】：
期刊论文
[1]C基因截短型HBV载体的复制、包装与表达[J]. 韩聚强,胡大荣,孙殿兴,胡学玲,李娟,范公忍,刘超英,吴忆贫.  中华传染病杂志. 2004(01)
[2]以乙型肝炎病毒为载体的基因治疗研究[J]. 韩聚强,胡大荣,胡学玲,孙殿兴,范公忍,刘超英,吴忆贫.  中华肝脏病杂志. 2003(06)
[3]携带外源基因的HBV在HepG2细胞中的表达与复制[J]. 韩聚强,胡大荣,孙殿兴,吴忆贫.  中华微生物学和免疫学杂志. 2003(01)
[4]基因重组HBV联合表达反义RNA和显性阴性突变体抗HBV作用及HBV包装细胞系的构建[J]. 孙殿兴,胡大荣,邬光惠,胡学玲 100700,李娟,范公忍.  中华肝脏病杂志. 2002(04)
[5]重组逆转录病毒载体携带乙型肝炎病毒载体的构建与表达[J]. 孙殿兴,胡大荣,邬光惠,胡学玲,李娟,范公忍.  中华实验和临床病毒学杂志. 2002(02)
[6]逆转录病毒载体携带HBV载体表达显性阴性突变体抗HBV作用的研究[J]. 孙殿兴,胡大荣,邬光惠,胡学玲,李娟,范公忍,邓涛.  肝脏. 2001(S1)



本文编号：2934959