条件性胰岛β细胞CASK基因敲除小鼠的构建及鉴定

发布时间：2020-12-30 04:50

　　目的:构建条件性胰岛β细胞钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶（calcium/calmodulin-dependent serine protein kinase,CASK）基因敲除小鼠,为研究CASK基因在糖尿病发生中的机制提供动物模型。方法:将CASKloxp/-雌鼠与CASKloxp/Y雄鼠杂交,获得基因型为CASKloxp/loxp雌鼠、CASKloxp/Y雄鼠;再让条件性胰岛β细胞特异性表达Cre重组酶雄鼠与CASKloxp/loxp雌鼠杂交获得CASKloxP/YMIP-Cre雄鼠和CASKloxP/-MIP-Cre雌鼠。CASKloxP/YMIP-Cre基因型小鼠即为本实验所需要构建的模型小鼠。小鼠生后1～2周剪尾,通过PCR鉴定小鼠基因型,4～5周龄时腹腔注射他莫昔芬诱导Cre重组酶表达后,利用实时荧光定量PCR、蛋白质印迹技术验证CASK基因敲除效果。结果:从引进这两种小鼠开始,繁殖10个月,共获得基因型为CASKloxP/YMIP-Cre的雄鼠28只,PCR结果证实小鼠基因型符合CASKloxP/YMIP-Cre。实时荧光定量PCR、蛋白质印迹结果显示CASKloxP... 

【文章来源】：南京医科大学学报(自然科学版). 2019年09期 北大核心

【文章页数】：7 页

【部分图文】：

表达Cre重组酶小鼠基因型鉴定FSgure2GenotypinRresultsofCrerecombinasemice

2结果2.1CASKloxp/-、CASKloxp/loxp、CASKloxp/Y、MIPCre、CASKloxp/-MIPCre和CASKloxp/YMIPCre小鼠繁殖及鉴定在获得CASKloxp/-杂合子小鼠后（图1A），与C57BL/6小鼠杂交，不断扩大CASKloxp/-小鼠、CASKloxp/Y小鼠数量，再将CASKloxp/-小鼠与CASKloxp/Y小鼠杂交，可获得的基因型有CASKloxp/-、CASKloxp/loxp、CASKloxp/Y和野生型（C57BL/6），子代小鼠皮肤及毛发均为黑色，部分子代小鼠基因型鉴定结果如图1B；MIPCre小鼠（黑色）和C57BL/6小鼠（黑色）杂交，可获得Cre重组酶阳性小鼠（MIPCre小鼠）和Cre重组酶阴性小鼠，部分子代小鼠基因型鉴定结果如图2；然后将CASKloxp/loxp雌鼠与MIPCre雄鼠杂交，可获得的基因型有CASKloxp/-、CASKloxp/Y、CASKloxp/-MIPCre和CASKloxp/YMIPCre，部分子代小鼠基因型鉴定结果如图3。2.2CASK基因敲除效果验证KO小鼠胰岛中CASKmRNA表达水平明显低于WT小鼠（图4A），差异有统计学意义（P<0.05）；KO小鼠胰岛中CASK蛋白表达水平较WT小鼠明显降低，半定量分析结果显示敲除效率约64%（图4B）。同时提取KO小鼠和WT小鼠的肝、肾、大脑、下丘脑等组织蛋白进行Westernblot检测，发现KO小鼠和WT小鼠在肝、肾等其他组织中的CASK蛋白表达水平无明显差异（图5）。2.3KO小鼠的体重检测对正常饮食的KO小鼠和WT小鼠的体重进行监测（4~8周），结果显示KO小鼠与WT小鼠相比，生长速度无明显差异（图6）。3讨论CASK广泛表达于脑、肝、肌肉、脂肪和胰腺等组

【参考文献】：
期刊论文
[1]IL-1β、TNF-α和IFN-γ对小鼠胰岛β细胞中lncRNA表达谱的影响[J]. 孙春涛,薛丽华,朱子阳,张凡,杨瑞雪,袁雪雯,刘倩琦.  南京医科大学学报(自然科学版). 2016(07)
[2]促炎性细胞因子对大鼠胰岛β细胞miR-29家族及抗凋亡蛋白表达水平的影响[J]. 陈玮,殷荔,缪爱梅,倪世宁,朱子阳,刘倩琦.  南京医科大学学报(自然科学版). 2015(06)



本文编号：2947017