迟钝爱德华氏菌侵染巨噬细胞以及扩散感染机制的初步研究

发布时间：2017-04-09 12:11

  本文关键词：迟钝爱德华氏菌侵染巨噬细胞以及扩散感染机制的初步研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)是一种重要的胞内寄生革兰氏阴性病原菌,能够在巨噬细胞内存活并复制是其重要的一个致病机理。但是目前对于迟钝爱德华氏菌与巨噬细胞的相互作用的胞内过程和具体机制还不是很清楚。本课题中,通过透射电镜发现迟钝爱德华氏菌在一个膜包裹的囊泡结构中存在并复制,我们称之为含菌囊泡(Edwardsiella-containing vacuole, ECV)。通过荧光显微镜发现,内化的迟钝爱德华氏菌能够在巨噬细胞内不均一性的复制,其中有一部分细胞内含有超级增殖的菌,占总细胞数的30%左右。这部分超级增殖的细菌能够在巨噬细胞内诱导焦亡导致细胞膜的破裂,表现为caspase-1的激活以及IL-1β的释放,细菌利用这种细胞死亡途径从细胞内被释放到胞外,为进一步感染提供了条件。将这部分从巨噬细胞内释放的迟钝爱德华氏菌与同步体外培养的迟钝爱德华氏菌相比较,结果发现它们具有更强的二次感染能力,能够在二次感染中引起一种依赖于caspase-3和组织蛋白酶B/D的快速细胞死亡,也具有更强的抵抗宿主杀伤能力,包括对活性氧、酸性环境、血清和中心粒细胞的杀伤抵抗。将从巨噬细胞内释放的迟钝爱德华氏菌与同步体外培养的细菌等量混合后感染小鼠,从巨噬细胞内释放的迟钝也表现出压倒性的竞争优势,具有更强的毒力。这些结果表明,迟钝爱德华氏菌通过在巨噬细胞内的复制与增殖使其本身的毒力得到了增强,可能为进一步扩散感染做好准备。进一步的转录水平结果揭示出,从巨噬细胞中逃离的迟钝爱德华氏菌的大量毒力相关基因的表达水平受到明显的调控,包括毒力相关的T3SS、 T6SS和其它压力应激相关的基因,这些基因变化的综合结果可能导致了其毒力水平的增强。综上所述,我们发现迟钝爱德华氏菌能够利用巨噬细胞作为一个短暂的避难所进行胞内复制和侵染驯化,为进一步扩散感染提供条件。
【关键词】：迟钝爱德华氏菌 巨噬细胞 侵染驯化
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R378
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 第1章 文献综述11-20
• 1.1 迟钝爱德华氏菌及其致病机制11-13
• 1.1.1 迟钝爱德华氏菌的基本介绍11
• 1.1.2 迟钝爱德华氏菌的毒力机制研究进展11-13
• 1.2 宿主免疫系统13-16
• 1.2.1 先天性免疫系统13-16
• 1.2.2 适应性免疫系统16
• 1.3 病原菌侵染宿主细胞的机制研究16-18
• 1.3.1 病原菌入侵机制17
• 1.3.2 病原菌胞内存活机制17-18
• 1.4 细胞死亡18-19
• 1.4.1 凋亡18
• 1.4.2 焦亡18-19
• 1.5 本课题的主要内容和意义19-20
• 第2章 E.tarda侵染巨噬细胞的胞内过程及机制20-35
• 2.1 引言20
• 2.2 实验材料20-22
• 2.2.1 药品与仪器设备20
• 2.2.2 菌株、质粒及细胞株20
• 2.2.3 培养基20-22
• 2.2.4 常用试剂22
• 2.2.5 主要技术服务及软件22
• 2.3 实验方法22-27
• 2.3.1 大肠杆菌感受态细胞的制备22-23
• 2.3.2 大肠杆菌的钙转化23
• 2.3.3 细菌质粒和基因组提取23
• 2.3.4 迟钝爱德华氏菌感受态细胞的制备23
• 2.3.5 迟钝爱德华氏菌的电转化23-24
• 2.3.6 DNA的琼脂糖凝胶电泳24
• 2.3.7 DNA产物纯化及DNA电泳胶回收24
• 2.3.8 PCR方法24
• 2.3.9 菌落PCR24-26
• 2.3.10 体外条件下荧光强度的检测26
• 2.3.11 巨噬细胞J774A.1的培养26
• 2.2.12 巨噬细胞内细菌侵染动力学的测定26-27
• 2.3.13 倒置荧光显微镜实时观察胞内细菌复制27
• 2.3.14 透射电镜样品制备27
• 2.4 实验结果27-32
• 2.4.1 迟钝爱德华氏菌荧光标记菌株的构建27-28
• 2.4.2 迟钝爱德华氏菌荧光标记菌株体外表达荧光强度的测定28-29
• 2.4.3 迟钝爱德华氏菌侵染巨噬细胞J774A.1的侵染动力学29-30
• 2.4.4 迟钝爱德华氏菌野生株利用T3SS在巨噬细胞内的增殖30-31
• 2.4.5 迟钝爱德华氏菌在巨噬细胞J774A.1内的定位31-32
• 2.5 讨论32-33
• 2.6 结论33-35
• 第3章 E.tarda诱导巨噬细胞焦亡而逃离巨噬细胞35-46
• 3.1 引言35
• 3.2 实验材料35-37
• 3.2.1 药品与仪器设备35
• 3.2.2 菌株,质粒及引物35
• 3.2.3 常规培养基以及试剂35-37
• 3.3 实验方法37-39
• 3.3.1 荧光定量PCR(qRT-PCR)37
• 3.3.2 炎症小体激活检测37-38
• 3.3.3 酶联免疫吸附(ELISA)38-39
• 3.3.4 细胞毒性LDH检测39
• 3.4 实验结果39-44
• 3.4.1 迟钝爱德华氏菌侵染巨噬细胞后凋亡基因的检测39-41
• 3.4.2 迟钝爱德华氏菌侵染巨噬细胞后细胞死亡的检测41
• 3.4.3 迟钝爱德华氏菌侵染巨噬细胞后期引起细胞死亡类型的检测41-43
• 3.4.4 迟钝爱德华氏菌逃离到细胞上清中的活菌数检测43-44
• 3.5 讨论44
• 3.6 总结44-46
• 第4章 逃离巨噬细胞的E. tarda野生株的毒力增强46-62
• 4.1 引言46
• 4.2 实验材料46-47
• 4.2.1 药品与仪器设备46
• 4.2.2 菌株、细胞及小鼠46
• 4.2.3 细胞培养基46-47
• 4.2.4 化学试剂47
• 4.2.5 抑制剂47
• 4.3 实验方法47-52
• 4.3.1 从巨噬细胞中逃离出来的EIB202和同步培养的EIB202细菌的制备47
• 4.3.2 小鼠原代肺和肾细胞的分离和培养47-48
• 4.3.3 迟钝野生株EIB202的二次侵染实验48
• 4.3.4 细菌侵染细胞粘附率和内化率48-49
• 4.3.5 DAPI和PI染色49
• 4.3.6 抑制剂实验49
• 4.3.7 细胞内化抑制实验49
• 4.3.8 压力应激实验49
• 4.3.9 小鼠血清的分离49-50
• 4.3.10 抗血清杀伤实验50
• 4.3.11 中心粒细胞的分离与培养50-51
• 4.3.12 抗中心粒细胞杀伤实验51
• 4.3.13 小鼠竞争性实验51-52
• 4.3.14 小鼠存活率实验52
• 4.4 实验结果52-59
• 4.4.1 从巨噬细胞中逃离的EIB202在二次感染中引起细胞死亡的检测52-56
• 4.4.2 从巨噬细胞中逃离的EIB202在二次感染中引起细胞死亡类型的检测56-58
• 4.4.3 从巨噬细胞中逃离的EIB202抵抗宿主杀伤能力的检测58-59
• 4.4.4 从巨噬细胞中逃离的EIB202的小鼠体内存活能力检测59
• 4.5 讨论59-61
• 4.6 小结61-62
• 第5章 从转录组水平考察E.tarda毒力增强的分子机制62-65
• 5.1 引言62
• 5.2 实验材料62
• 5.2.1 药品与仪器设备62
• 5.2.2 菌株、细胞62
• 5.2.3 主要技术服务及软件62
• 5.3 实验方法62-63
• 5.3.1 从巨噬细胞中逃离出的EIB202和同步培养的EIB202的制备62
• 5.3.2 细菌RNA的抽提62
• 5.3.3 RNA-seq基因转录水平分析62-63
• 5.4 实验结果及讨论63-64
• 5.5 小结64-65
• 第6章 结论与展望65-67
• 6.1 总结65-66
• 6.2 展望66-67
• 参考文献67-73
• 致谢73

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