小鼠胸腺衰老相关新基因的克隆及功能鉴定

发布时间：2021-01-03 04:57

　　特异性免疫应答依赖于T淋巴细胞，而胸腺是T淋巴细胞发育和分化的重要场所。T细胞的前体细胞从骨髓迁移至胸腺，在胸腺经历了阴性选择和阳性选择，最终只有5％的T细胞发育成熟并输出到外周淋巴器官发挥免疫应答功能。对于免疫系统而言，胸腺处于十分重要的地位，在机体衰老过程中，胸腺比其它器官表现出更明显的增龄性改变—退化（萎缩）。我们推测这一过程必然与其它代谢过程一样受控于遗传，伴随众多基因的参与。然而，迄今为止我们对其基因调控机制还所知甚少。因此，从胸腺中寻找与衰老相关的未知或已知基因，并探讨它们在T淋巴细胞分化发育及衰老过程中的作用将有助于深入阐明老化免疫的机制。 为了寻找增龄相关性胸腺基因，本研究采用了以下研究策略与路线：首先，采用差异显示反转录PCR技术（DDRT-PCR）对1月和10月龄小鼠胸腺mRNA的差异表达情况进行了分析；其次，以基因的差异片段（EST，expressed sequence tag）进行Northern杂交以鉴别其假阳性；再次，综合运用EST筛选cDNA文库、cDNA末端快速扩增（RACE）、EST拼接结合RT—PCR等实验技术克隆差异片段所代表的全长基因；随之... 

【文章来源】：北京协和医学院北京市 211工程院校 985工程院校

【文章页数】：100 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

回收差异产物的再扩增..一eoe

Balb/c小鼠胸腺mRNA的DDRT一PCR分析道为l月龄小鼠胸腺mRNA;第2、4、6、异基因的表达:刁卜:显示同一基因的表sisofrexPressionofmRNArfoml一or10一momRNArforn10一montholdmiee;LaneZ，4，6，8.一卜rePresentsuniquemRNAexPressionds允:di价rentIeve一ofidentiea[thymiem

记后作为探针，以日一actni为内对照，分别与1月和10月龄小鼠胸腺总RNA进行Northem杂交。根据放射自显影的所显示的杂交信号强弱，判定31个探针为阳性。同时根据阳性信号的位置，亦可大致判断转录本的大小。图1.4是其中部分的六杂交结果。一aCtin图1.4差异显示DNA片段sh38、sh6、sh13、sh97与1和10月龄小鼠胸腺总RNA的Northern印迹杂交结果.(A、B、C、D:10月龄小鼠胸腺TotalRNA:a、b、e、d:l月龄小鼠胸腺TotalRNA龄小鼠胸腺TotalRNA)Fig1.4NorthernblothybridizationofdifferentialdisplayDNAfragmentsh38，sh6，sh13andsh97withthymistotalRNAderivedfroml一or10一monthmieeresPeetively.LaneA、B、C、D:thymusfrom10一monthmouse:Lanea、b、e、d:thymusfroml一monthmouse产.23差异片段亚克隆及测序由于PCR扩增中TaqDNA聚合酶往往会在PCR产物的3’端加上一个A，可以与pGEM一Taeys载体上的T相连，连接产物可转化大肠杆菌DHS。。通过蓝白斑筛选，挑出白色克隆，小提质粒，用EocRI内切酶对重组质粒进行酶切鉴定。电泳鉴定结果见图1.5。对含有插入片段的重组质粒，进行测序。

【参考文献】：
期刊论文
[1]绿色荧光蛋白及其应用[J]. 张峰,任燕,陆长德.  生命科学. 1999(02)



本文编号：2954359