蛋白质—配体及蛋白质—细胞相互作用的研究策略

发布时间：2021-01-10 20:31

　　蛋白质几乎参与所有的生物学过程。他们通过与其他蛋白质或者其他分子发生相互作用行使功能。本论文建立了两个研究蛋白质相互作用的蛋白质组学新策略：4Facts策略用于鉴定实时的蛋白质-配体相互作用；4S策略用于整体分析蛋白质-细胞相互作用。4Facts策略——快速固定（Fast Fix）、亲和捕获（Fish）、分子量筛选（Filter）,可以在不对生物学样品进行预先干预的条件下全面、灵敏而准确地研究实时原位的蛋白质-配体相互作用。在本策略中,SDS-PAGE （十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）被用于打断非共价结合以去除未被共价交联的复合物,以及提供分子量信息用于筛选配体蛋白。候选蛋白被认定为靶蛋白的配体蛋白,需要同时满足以下三个条件：第一,必须与靶蛋白在同一胶条中被鉴定；第二,必须在实验组胶条中被鉴定,而不出现在相同、相邻或更高分子量范围的对照组胶条中；第三,所在胶条的分子量范围包含或大于它与靶蛋白的理论分子量之和。我们将4Facts策略应用于人血液中的蛋白质-配体相互作用,以血浆白蛋白以及转铁蛋白为例展示该策略的可行性。人血液不经任何处理被直接加入10%的甲醛溶液中进行5秒的快速交联反应... 

【文章来源】：北京协和医学院北京市 211工程院校 985工程院校

【文章页数】：134 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

Facts策略技术路线（T:紀蛋白）

免疫印迹实验。如图3B,单个白蛋白为主要的显色条带，在各个交联条件中的量基本相等。0 %甲酸鮮育的未交联样品在单个白蛋白的分子量以外，更高的分子量区域无焚光信号。0 S交联样品在高分子量区几乎没有荧光信号（极弱的信号可能由白蛋白量大有拖尾而产生）。其余交联条件均在比白蛋白单个分子的分子量高的区域有弥散，并且在70-100 kDa、130-I80 kDa之间有条带。与一维变性凝胶相对应：1 %甲酸交联的样品条带最浅，可能是受到甲酸的量的限制；20 %及40 %甲醛交联样品中70-100 kDa间的条带信号强，但更高分子量处未见弥散增加；甲酸浓度10%之下交联产物的量没有随着交联时间的增加而增加。结果说明：交联反应发生迅速，5秒交联时间足够；10%的甲醛浓度合适，增加浓度没有明显增加交联产物；白蛋白大多数以单个分子的形式存在。3.1.2.5小结及讨论交联产物的多少取决于样品本身存在的蛋白质-配体相互作用的量

我们将白蛋白免疫沉淀和凝胶电泳之后70 kDa以下的凝胶进行考马斯亮蓝染色。如图4所示，实验组70 kDa左右有明显条带，为白蛋白的条带，70 kDa以下的明显条带为抗体重链，表面抗体成功地将白蛋白捕获下来，且白蛋白及抗体均不过载量。而对照组在相应的白蛋白及抗体重链处仅有极其微弱的条带，PBS洗漆条件太弱，可能存在极少量的非特异性结合。3.1.3.3质谱鉴定(1)候选的白蛋白配体实验组为交联样品加白蛋白抗体进行免疫沉淀，对照组为交联样品不加抗体进行相同操作。免疫沉淀之后的样品在梯度胶中进行SDS-PAGE分离。不经过染色，70 kDa以上的全部凝胶区域被按照分子量切为六部分：70-100 kDa, 100-130 kDa,130-180 kDa, 180-250 kDa


本文编号：2969361