GATA4和HNF4α介导的人脐带间充质干细胞向肝细胞定向分化的研究

发布时间：2017-04-11 19:10

  本文关键词：GATA4和HNF4α介导的人脐带间充质干细胞向肝细胞定向分化的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：肝细胞是肝脏生理功能的主要执行者，在基础研究，，药物研发及肝病细胞治疗中具有重要的应用价值，然而肝细胞来源短缺的状况严重地制约着相关领域的研究进展，并阻碍了其临床转化应用的进程。因此，探索如何获取大量、纯净、健康、合格的肝细胞具有非常重要的意义。由于直接分离的原代肝细胞培养相对困难且供体来源短缺，因此从易于培养的细胞诱导获得功能性肝（样）细胞成为国内外的研究热点。目前这方面的研究取得了显著进展，但是由于某些不可避免的局限性，这些诱导起始细胞或诱导策略各有优劣。其中，人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)不仅具有干细胞的特性，而且来源丰富、取材方便、扩增迅速，还具有更低的免疫原性及一定的肝源性，成为目前理想的诱导性肝样细胞来源。本研究借鉴体细胞直接转分化为肝样细胞的诱导策略，采用慢病毒介导的转基因技术，将肝富集转录因子GATA4和HNF4α转入hUC-MSCs中，进行肝细胞方向的定向诱导分化，取得了较好的结果。 本研究利用组织块贴壁培养法，从脐带基质分离获得了生长性状稳定，均质性良好的hUC-MSCs。在组织块贴壁培养3~4d时，观察到组织块间隙有小三角形或纺锤形细胞铺展开来，培养至第7d时取出组织块，继续培养一周左右，细胞汇合至约90%时进行传代。传代后，细胞约4h贴壁，2d后迅速生长，呈现典型的成纤维细胞样形态，具有清晰的轮廓及内部应力纤维，多为星形或纺锤形的扁平状结构，其细胞核呈卵圆形，核仁大而明显；当细胞基本达到完全汇合时，呈平行排列或漩涡生长。通过细胞免疫荧光染色鉴定分离获得的细胞几乎全部为CD44阳性。 本研究以上述分离、鉴定的hUC-MSCs为诱导肝细胞的起始细胞。利用磷酸钙转染法将包含GATA4或HNF4α的慢病毒表达载体和包装系统质粒共转入HEK293T细胞，制备重组慢病毒。用两种重组慢病毒侵染P6代的hUC-MSCs，在侵染后约两周，可观察到表达GFP的、具有典型上皮样细胞形态的的肝样细胞克隆，其体积较小，细胞核较大，有1~3个核仁，呈小三角形或不规则形上皮样，大多数细胞有胞质突起。通过RT-PCR检测到，hUC-MSCs本身表达部分肝系基因CK19、EpCAM、CK18、ALB、G6P、GLUL和MET；而诱导细胞除表达上述基因外，与诱导前的hUC-MSCs相比，开启了TAT的表达，抑制了IL6的表达；功能检测显示部分诱导细胞具有成熟肝细胞摄取与排泌ICG的功能。 综上结果表明，本研究从脐带基质获得了具有肝源性的hUC-MSCs，并进一步利用肝富集转录因子组合GATA4和HNF4α诱导其定向分化为具有肝细胞特性的肝样细胞。
【关键词】：脐带间充质干细胞 肝样细胞 GATA4 HNF4α 细胞分化
【学位授予单位】：河南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 缩略语表11-13
• 第一部分 文献综述13-31
• 1 hUC-MSCs 向肝样细胞分化的研究进展14-21
• 1.1 hUC-MSCs 的生物学特性14-16
• 1.2 hUC-MSCs 向肝样细胞分化的体外研究16-18
• 1.3 hUC-MSCs 向肝样细胞分化的体内及临床研究18-20
• 1.4 hUC-MSCs 的应用所面临的问题与前景20-21
• 2 肝样细胞的诱导方法21-26
• 2.1 细胞因子诱导法21-23
• 2.2 转录因子诱导法23-24
• 2.3 miRNA 诱导法24-25
• 2.4 微环境诱导法25-26
• 3 肝富集转录因子的功能26-28
• 3.1 GATA4 在肝脏发育中的功能27
• 3.2 HNF4α在肝脏发育中的功能27-28
• 4 本研究的目的和意义28-31
• 4.1 研究目的28
• 4.2 研究意义28-31
• 第二部分 材料和方法31-46
• 1 实验材料31-34
• 1.1 实验细胞及质粒31
• 1.2 主要试剂与溶液配置31-33
• 1.3 实验室仪器设备33
• 1.4 主要耗材33-34
• 2 实验方法34-46
• 2.1 质粒的提取34
• 2.2 感受态细胞的制备34-35
• 2.3 重组慢病毒载体的构建35-36
• 2.4 hUC-MSCs 的分离、培养与鉴定36-38
• 2.5 鼠尾胶原蛋白的制备及包被38-39
• 2.6 细胞的复苏及培养39
• 2.7 慢病毒的制备与侵染性能检测39-40
• 2.8 肝样细胞的诱导及诱导细胞的培养40-41
• 2.9 诱导细胞的检测41-46
• 第三部分 结果和讨论46-60
• 1 GATA4 和 HNF4α基因扩增及其重组慢病毒载体的构建46-47
• 2 hUC-MSCs 的分离、培养与鉴定结果47-48
• 2.1 hUC-MSCs 的分离、培养结果47
• 2.2 hUC-MSCs 表面标记物 CD44 的免疫荧光鉴定结果47-48
• 3 重组慢病毒的制备结果48-49
• 4 重组慢病毒的浓缩及其侵染性能的检测结果49-50
• 5 hUC-MSCs 向肝细胞定向分化的诱导结果与分析50-53
• 5.1 GATA4 和 HNF4α重组慢病毒对 hUC-MSCs 的侵染结果50-51
• 5.2 GATA4 和 HNF4α介导的 hUC-MSCs 向肝细胞定向分化的结果51-52
• 5.3 RT-PCR 法分析诱导细胞的基因表达情况52
• 5.4 诱导细胞的功能检测—ICG 的摄取与排泌52-53
• 6 小结53
• 7 讨论53-60
• 结论60-62
• 参考文献62-71
• 致谢71-72
• 攻读硕士学位期间参加的科研项目和发表论文72-73

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