培美曲塞诱导神经管畸形动物模型及其机制的研究

发布时间：2021-01-26 03:58

　　研究目的：本研究利用抗叶酸代谢药培美曲塞（PMX）对C57BL/6J孕鼠进行药物干预,通过对孕鼠胚胎形态学观察及其他指标的检测,筛选出最佳的给药剂量和时间,建立叶酸代谢障碍的C57BL/6J小鼠胚胎神经管畸形（neural tube defects, NTDs）动物模型；采用微阵列比较基因组杂交技术（aCGH）检测PMX诱导NTDs模型基因组拷贝数变异；应用全基因组表达谱芯片技术检测PMX诱导NTDs模型的基因表达谱,筛选可能的PMX引起NTDs的致病基因；初步探讨PMX对NTDs发生发展的影响及相关发病机制的研究。研究方法：本研究中将7-8周健康雌性C57BL/6J小鼠随机分两组受孕,给药实验组于孕7.5（E7.5）天腹腔注射PMX,摸索适当的给药剂量并建立神经管畸形动物模型,正常对照组按体重注射同等剂量的生理盐水。在孕11.5（E11.5）天,颈椎离断处死实验组和正常对照组孕鼠,取胚胎于在解剖显微镜下观察胚胎神经管畸形的外部特征；经固定、切片、染色后,光镜下观察畸胎情况及神经管形态改变；高效液相色谱法首先测定PMX干预孕鼠的不同时间点的叶酸及代谢产物水平；ELISA方法检测PMX诱... 

【文章来源】：山西医科大学山西省

【文章页数】：110 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩写对照表
前言
第一部分 培美曲塞诱导神经管畸形小鼠模型的建立
    1 前言
    2 材料
        2.1 实验动物来源及饲养
        2.2 实验试剂
        2.3 实验器材
        2.4 溶液配制
    3. 方法
        3.1 神经管畸形动物模型的建立
        3.2 取材
        3.3 组织病理检测
        3.4 数据分析
    4. 结果
    5. 讨论
第二部分 PMX诱导神经管畸形小鼠胚胎中叶酸及其代谢产物的改变
    1. 前言
    2. 材料
        2.1 实验动物来源及饲养
        2.2 实验动物分组
        2.3 主要仪器
        2.4 试剂
    3. 实验方法
        3.1 高效液相色谱方法检测叶酸（FA）、5甲基四氢叶酸（5-MeTHF），5甲酰四氢叶酸（5-FoTHF） , S腺昔甲硫氨酸（SAM），S腺苷同型半胱氨酸（SAH）的含量
        3.2 ELISA方法检测叶酸的含量
        3.3 DHFR的活性测定
        3.4 叶酸代谢过程关键酶的mRNA表达水平测定
        3.5 统计学分析
    4. 实验结果
        4.1 高效液相色谱方法检测PMX对叶酸及相关代谢产物水平的影响
        4.2 ELISA方法检测PMX对叶酸水平的影响
        4.3 PMX降低神经管畸形小鼠胚胎的DHFR活性
        4.4 亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）和腺苷酸合成酶（TS）的mRNA表达
    5. 讨论
第三部分 PMX诱导神经管畸形小鼠胚胎基因组拷贝数变异的检测及变异基因的筛选
    1 前言
    2 材料
        2.1 实验动物来源及饲养
        2.2 实验仪器
        2.3 实验试剂
    3 实验方法
        3.1 实验动物分组
        3.2 aCGH方法检测小鼠胚胎基因组拷贝数变异
        3.3 全基因组表达谱芯片技术筛选PMX诱导的NTDs小鼠胚胎组织变异基因
        3.4 RT-PCR检验变异基因变化水平
        3.5 统计学分析
    4 实验结果
        4.1 aCGH方法检测筛选出拷贝数变异
        4.2 全基因组表达芯片RNA质量检测结果
        4.3 数据分析
        4.4 SAM软件分析结果
        4.6 RT-PCR方法验证基因筛选结果
    5 讨论
第四部分 PMX诱导NTDs动物模型中胚胎干细胞DNA的改变
    1 前言
    2 材料
        2.1 细胞来源及主要试剂
        2.2 主要仪器
        2.3 试剂的配制
    3 实验方法
        3.1 小鼠胚胎干细胞培养
        3.2 小鼠胚胎干细胞ESC的传代及冻存
        3.3 小鼠胚胎干细胞ESC的给药及处理
        3.4 DHE荧光探针检测细胞内活性氧（ROS）
        3.5 单细胞凝胶电泳实验（彗星实验）
        3.6 细胞内GSH和MDA含量的测定
        3.7 统计学分析
    4 实验结果
        4.1 PMX诱导SV129 ESC细胞中ROS水平明显上调
        4.2 PMX诱导SV129 ESC细胞中DNA损伤明显增加
        4.3 ELISA方法检测PMX增加胚胎干细胞内GSH和MDA的含量
    5 讨论
全文小结
结论
综述
参考文献
攻读博士学位期间发表的文章
致谢
个人简历


【参考文献】：
期刊论文
[1]丹参、川芎、红花合煎剂对大鼠心肌缺血模型心肌细胞凋亡的影响[J]. 王晓雨,秦锋,黄熙,张学娅,任平,赵宏卫.  中药材. 2009(05)
[2]神经管畸形高、低发区农村孕早期妇女血液叶酸水平比较研究[J]. 张乐,任爱国,李智文,郝玲,田熠华,李竹.  中华流行病学杂志. 2006(08)



本文编号：3000429