人真皮微血管内皮细胞的原代培养及低氧/复氧模型的建立

发布时间：2021-01-27 21:10

　　目的:培养人真皮微血管内皮细胞,建立人真皮微血管内皮细胞低氧/复氧模型。方法:采用酶消化及联合磁珠分选法,得到人真皮微血管内皮细胞（HDMECs）,体外培养传至P5代,采用Ⅷ因子免疫荧光及CD309、CD34流式细胞学进行鉴定。用缺氧Buffer加低氧舱的方法低氧处理P5代HDMECS。实验分为四组,Con组不做任何处理、H8组低氧8小时组,H8R12组低氧8小时复氧12小时组、H8R24组低氧8小时复氧24小时组。TUNEL（脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法）染色法检测细胞凋亡,蛋白质印迹法（Western Blot）检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）蛋白的表达。结果:联合法分离的细胞,经过2次CD31磁珠分选后,可见细胞短梭形,呈铺路石样。细胞传至P5,Ⅷ因子免疫荧光染色阳性率为（95±2.61）%。流式细胞仪检测CD309阳性率为（95.4±1.34）%;CD34阳性率为（42.5±3.23）%。TUNEL染色、Western Blot结果显示:H8组的细胞凋亡率和活化的Caspase-3表达高于Con组（P<0.05）,H8R12组、H8R2... 

【文章来源】：心肺血管病杂志. 2015,34(02)

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【部分图文】：

人皮瓣微血管内皮细胞体外培养A:细胞生长4天

统计学意义。结果1．皮瓣微血管内皮细胞的分离及鉴定:细胞分离培养4天后，可见散在的细胞集落(图1A)，周边有成纤维状细胞生长，细胞集落生长7天后，可见细胞呈铺路石样排列(图1B);此时，细胞经第1次磁珠分选，体外培养2天，可见细胞呈多角形或拖尾短梭状生长(图1C);体外培养4天后，经第2次分选，可见细胞呈紧密排列的漩窝状或同心圆状外观，呈铺路石样排列(图1D)。2．免疫荧光:第1次磁珠分选后，随机计算4个高倍镜下Ⅷ因子免疫荧光染色阳性细胞率，阳性率为(45.3±5.2)%。第二次磁珠分选后阳性率＞95%(图2)。图3HDMECS流式鉴定结果A:CD309PE标记检测结果;B:CD34FITC标记检测结果3．CD309、CD34流式鉴定:流式细胞鉴定结果:CD309阳性率为(95.4±1.34)%;CD34阳性率为(42.5±3.23)%(图3)。4．TUNEL染色检测细胞凋亡结果:Con组阳性率为(3±1.2)%，H8组阳性率为(7.2±1.8)%，H8Ｒ12组阳性率为(15.3±1.3)%，H8Ｒ24组阳性率为(16.5±2)%。低氧使细胞凋亡数量增加，H8组与Con组比较凋亡增高(P＜0.05);复氧增加细胞损伤，H8Ｒ12组、H8Ｒ24组阳性率与H8组比较增加更明显(P＜0.05，图4)。5．WesternBlot检测活化的Caspase-3蛋白的表达结果未活化的caspase-3的条带在32kDa附近;活化的caspase-3条带在17kDa附近。H8组活化的Caspase-3表达明显高于Con组(P=0.025)。H8Ｒ12组、H8Ｒ24组活化的Caspase-3蛋白表达明显高于H8组(P＜0.05，图5)。134心肺血管病杂志2015年2月第34卷第2期JournalofCardiovascular＆PulmonaryDiseases，February2015，Vol．34，No．2

图4低氧复氧增加内皮细胞的凋亡A:TUNEL染色为绿色，DAPI染色为蓝色。B:TUNEL染色阳性细胞所占的比例，注:均与H8组比较，P＜0.05图5Caspase-3WesternBlot检测结果A:各组Caspase-3蛋白条带结果，B:活化的Capase-3WesternBlot灰度值结果，注:均与H8组比较，P＜0.05讨论随着显微外科技术的发展，游离皮瓣的运用越来越多，但出现的问题是，不能保证皮瓣较高的成活率。其中主要的原因是进一步皮瓣恢复血流后，再灌注反而加重皮瓣的损伤。以往研究认为内皮细胞在再灌注损伤中不仅仅是起着屏障作用，而且还协调着多形核细胞的转运［4］，在机体的缺血低氧及炎症等病理生理过程中起着重要的作用［5］。因此，建立HDMECs低氧/复氧模型对未来人皮瓣再灌注损伤机制的研究是非常迫切的。目前国内外对于皮瓣微血管内皮细胞的研究较少，未见关于酶消化联合磁珠分选培养HDMECs的研究。在国外皮瓣微血管内皮细胞提取和培养的方法仅见于小鼠，方法包括磁珠分选［6］和密度梯度离心［7］的方法，国内仅有胡大海等［8］采用胰酶和中性蛋白酶消化的方法对HDMECs的分离培养进行了报道。本研究首次采用Dispase酶Ⅱ以及胶原酶Ⅰ消化联合2次磁珠分选的方法提取培养人皮瓣微血管内皮细胞。显微镜下观察细胞的生长特点具有内皮细胞的生长特征［8］，Ⅷ因子免疫荧光鉴定阳性率＞95%，流式细胞学检测CD309阳性率为(95.4±1.34)%;CD34阳性率为(42.5±3.23)%。本研究检测了部分HDMECS生物学特性，能为我们今后HDMECS培养的研究奠定基矗目前国内外用于细胞低氧的方法主要有缺氧Buffer和低氧舱两种办法。但是未有文献评价各自优缺点，而我们的研究采用缺氧Buffer加三气培养箱低氧环境对HDMECs进行低氧处理，是因为缺氧Buffer能让细胞

【参考文献】：
期刊论文
[1]三七总皂苷对大鼠腹部游离皮瓣存活的影响[J]. 王智,郅克谦,许志鹏,张瑞智.  实用药物与临床. 2014(04)
[2]小鼠肺微血管内皮细胞的培养鉴定及其血管形成功能的研究[J]. 高润娣,曹婕,卢珊,应琳,高璇,陆国华,李和权,周建英.  中国病理生理杂志. 2012(01)
[3]参附注射液对缺血/再灌注损伤诱导大鼠心肌细胞凋亡的实验研究[J]. 辛毅,吴永涛,顾云,黄益民.  心肺血管病杂志. 2010(03)
[4]TUNEL法原位检测心肌细胞凋亡的改进[J]. 董小莉,谭宁,符永恒,邓宇珺,孙凯亮.  中国病理生理杂志. 2010(05)
[5]细胞凋亡与冠心病[J]. 杨胜利.  中国动脉硬化杂志. 2003(04)
[6]人真皮微血管内皮细胞的体外分离和原代培养[J]. 胡大海,陈璧,汤朝武,韩军涛,姜笃银,苏映军,朱雄翔,贾赤宇,徐明达.  西北国防医学杂志. 1999(04)



本文编号：3003737