EB病毒早期基因BARF1和BHRF1启动子甲基化状态与表达的研究

发布时间：2017-04-12 19:04

  本文关键词：EB病毒早期基因BARF1和BHRF1启动子甲基化状态与表达的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)属人类疱疹病毒科γ疱疹病毒亚科成员,是重要的DNA病毒,具有致癌潜能。体内主要感染B淋巴细胞和某些上皮细胞,可导致B细胞源性肿瘤或上皮细胞源性肿瘤。EBV相关胃癌(EBV-associated gastric carcinoma, EBVaGC)及鼻咽癌组织中病毒基因表现为限制性表达,可能与表观遗传机制调控病毒基因启动子,尤其是其甲基化状态来调控病毒基因的表达有关。 目的探讨EBV早期基因BARF1启动子Ap和BHRF1启动子Hp甲基化状态及其对转录表达的影响,为进一步研究BARF1和BHRF1基因在EBV相关肿瘤发生中的作用机制提供实验基础。 方法选取EBV阳性细胞系(GT38, B95-8, GT39, Raji, PT, C666-1, OB, SNU719)和EBVaGC作为研究对象,采用5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理EBV阳性细胞系(GT38, B95-8, GT39, Raji),甲基化特异性PCR (Methylation-Specific PCR, MSP)以及亚硫酸氢盐基因组测序法(Bisulfite genomic sequencing, BGS)检测EBVaGC组织以及5-Aza-CdR处理前后EBV阳性细胞系中BARF1和BHRF1基因启动子Ap和Hp甲基化状态。同时采用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR, qRT-PCR)检测5-Aza-CdR处理前后BARF1和BHRF1基因的转录表达情况。 结果①MSP检测结果显示在EBV阳性细胞系中BARF1和BHRF1基因启动子Ap和Hp均存在不同程度的甲基化,在GT38, GT39, PT, C666-1和Raji细胞系呈完全甲基化,为M型；而在SNU719, B95-8和OB细胞系发生不完全甲基化,呈M+U型。②BGS检测结果显示,MSP产物电泳为M型的EBV阳性细胞系3种EBV早期基因启动子区几乎所有CpG位点均发生甲基化,而MSP产物电泳呈M+U型的EBV阳性细胞系1种EBV早期基因启动子区则表现为部分CpG位点的甲基化。③MSP结果显示EBVaGCs癌组织中BARF1基因启动子有31例为M型(31/43,72.1%),M+U型12例(12/43,27.9%); BHRF1基因启动子有36例呈M型(36/43,83.7%),M+U型7例(7/43,16.3%),表明2种早期基因的启动子均呈高甲基化状态。④MSP和BGS检测结果均显示EBV阳性细胞系B95-8,GT38和GT39在5-Aza-CdR处理后BARF1和BHRF1基因启动子甲基化程度降低。⑤去甲基化试剂5-Aza-CdR处理B95-8, Raji, GT38和GT39细胞系可使EBV早期基因基因BARF1和BHRF1的转录表达水平升高,其中BARF1基因在B95-8, Raji, GT38和GT39细胞系处理后表达水平分别为处理前的2.13,6.50,73.53和2.50倍,BHRF1基因在B95-8, Raji, GT38和GT39细胞系处理后表达水平分别为处理前的3.39,2.46,6.45和16.67倍。 结论①BHRF1基因的转录表达与其启动子甲基化程度密切相关,而BARF1基因的转录表达可能部分受其启动子甲基化的调控,因此甲基化是调控EBV主要早期基因启动子活动的重要机制之一。②EBV早期基因BARF1和BHRF1的甲基化状态和转录表达有一定关联性,表现为不同类型EBV阳性细胞系BARF1基因启动子Ap和BHRF1基因启动子Hp甲基化程度和转录表达有所不同；而在同一种细胞系,Ap和Hp甲基化程度以及BARF1和BHRF1基因的转录表达水平相似。③BVaGC组织中BARF1和BHRF1基因启动子呈高甲基化状态,推测甲基化可调控EBVaGC组织中两种基因的表达,使EBV处于潜伏期状态,进而逃避宿主的免疫监视,维持病毒的持续感染状态,在EBVaGC的发生发展中发挥一定作用。
【关键词】：EB病毒 胃癌 甲基化 启动子
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R373
【目录】：

• 中文摘要2-4
• Abstract4-7
• 引言7-9
• 第一章 材料与方法9-19
• 1.1 主要仪器、试剂和耗材9-10
• 1.2 EBV阳性细胞系及胃癌组织标本10-11
• 1.3 细胞培养及药物处理11
• 1.4 DNA的提取与修饰11-14
• 1.5 RNA的提取与处理14-16
• 1.6 BARF1和BHRF1基因启动子甲基化状态检测16-18
• 1.7 Real-time qPCR检测基因mRNA18
• 1.8 统计方法18-19
• 第二章 结果19-32
• 2.1 BARF1基因启动子Ap甲基化状态的检测结果19-24
• 2.2 BHRF1基因启动子Hp甲基化状态的检测结果24-29
• 2.3 Real-time qPCR检测细胞系药物作用前后基因的转录表达29-32
• 第三章 讨论32-38
• 3.1 EBV早期基因BARF1启动子Ap的甲基化33-35
• 3.2 EBV早期基因BHRF1启动子Hp的甲基化35-36
• 3.3 EBV相关肿瘤中病毒主要早期基因甲基化对EBV阳性肿瘤治疗的影响36-38
• 结论38-39
• 参考文献39-43
• 综述43-61
• 综述参考文献52-61
• 攻读学位期间研究成果61-62
• 致谢62-63

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 宋立兵,曾木圣,张玲,李满枝,廖雯婷,郑美莲,汪慧民,曾益新;EB病毒编码的BARF_1基因在人上皮细胞恶性转化中的作用[J];癌症;2004年S1期

2 梁华,罗兵,王云,王笑峰,丁守怡,黄葆华;胃癌和相应癌旁组织中EB病毒感染的检测[J];青岛大学医学院学报;2003年04期

3 路素丽;甘润良;;EB病毒基因甲基化与肿瘤的关系[J];医学综述;2011年06期

4 程玮;李玉梅;杨大俊;赵永强;;醋酸棉酚对Raji细胞增殖和凋亡的影响[J];中国医学科学院学报;2009年05期

  本文关键词：EB病毒早期基因BARF1和BHRF1启动子甲基化状态与表达的研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：301923