临床铜绿假单胞菌的毒力性能及穿心莲内酯对其的干预作用研究

发布时间：2017-04-12 22:15

  本文关键词：临床铜绿假单胞菌的毒力性能及穿心莲内酯对其的干预作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：第一部分临床铜绿假单胞菌生物膜形成的分析 目的：分析不同来源的临床铜绿假单胞菌生物膜形成能力。 方法：选择源自重庆医科大学附属儿童医院（49株），北京大学附属第一医院（14株）和浙江大学附属第一医院（32株）三家医院的临床铜绿假单胞菌共95株，其中痰液标本49株，血液标本30株，腹腔脓液、尿液、胆汁及其他来源标本共计16株。微量滴定板生物膜分析实验测定生物膜的成熟期及其形成能力的强弱；综合临床菌株的不同来源及生物膜形成能力，分析两者的相关性。 结果：所有不同来源的临床铜绿假单胞菌株均可以形成生物膜。49株分离自痰液的铜绿假单胞菌中有45株的生物膜形成能力强（91.8%），46株分离自血液、腹腔脓液、尿液、胆汁及其他来源的菌株中生物膜形成能力强的有33株（71.7%）；痰液来源和非痰液来源的临床菌株的生物膜形成能力强的菌株比率相比较，其差异有统计学意义（P＜0.05）。49株痰液来源的菌株生物膜到达成熟期的时间为3.63±1.20天，46株非痰液来源的菌株生物膜到达成熟期的时间为为4.27±1.23天，痰液组和非痰液组的生物膜成熟期形成时间进行比较，差异有统计学意义（p＜0.05）。 结论：不同临床分离铜绿假单胞菌株形成生物膜的能力差异较大。痰液来源的临床菌株较非痰液来源的临床菌株生物膜形成能力强，且痰液来源的临床菌株较非痰液来源的临床菌株到达生物膜成熟期所需的时间短。 第二部分穿心莲内酯对临床铜绿假单胞菌感染人支气管上皮细胞的影响 目的：制备铜绿假单胞菌感染人支气管上皮细胞（BEAS-2B）模型，研究穿心莲内酯对细菌感染性和其诱发宿主细胞炎性反应能力的影响。 方法：选择源自重庆、北京和浙江三家医院的临床铜绿假单胞菌，采用聚合酶链反应(Polymerase chain reaction, PCR)技术检测各临床菌株T3SS毒力效应分子的编码基因。根据其毒力效应分子编码基因的携带差异,选择Cq40（exoU+、exoS-、exoT+和exoY+）、Cq1（exoU-、exoS+、exoT+和exoY+）、Cq24（exoU-、exoS+、exoT-和exoY+）及Cq16（exoU+、exoS-、exoT-和exoY+）四株临床菌株，分别用于感染人支气管上皮细胞BEAS-2B。菌落计数法检测铜绿假单胞菌对BEAS-2B细胞的侵袭力；酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测铜绿假单胞菌感染BEAS-2B细胞后乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）的释放量及炎症因子白介素-6（Interleukin-6，IL-6）和IL-8（Interleukin-8，IL-8）的表达水平。用Luria-Bertani broth肉汤(LB肉汤)培养基，观察穿心莲内酯（浓度300μM）对细菌生长的影响。用不同浓度的穿心莲内酯（3μM和4.5μM）干预铜绿假单胞菌感染BEAS-2B，菌落计数法检测干预后铜绿假单胞菌对BEAS-2B细胞的侵袭力；用ELISA法检测穿心莲内酯干预BEAS-2B后LDH的释放量及炎症因子IL-6和IL-8的表达水平。 结果：95株分离自临床的铜绿假单胞菌T3SS毒力基因的携带率分别为exoU21%、exoS84.2%、exoT49.5%和exoY82.1%，重庆组（49株）中，20%携带exoU，90%携带exoS,59%携带exoT,携带91.8%exoY。杭州组（32株）中，28%携带exoU，69%携带exoS,25%携带exoT,63%携带exoY。北京组（14株）中7%携带exoU，100%携带exoS,71%携带exoT,93%携带exoY。将单个菌株进行毒力效应分子编码基因携带分型，可分为11种类型，其中exoU-、exoS-、exoT-和exoY-9株，只含exoU-、exoS+、exoT-和exoY-4株，含exoU-、exoS+、exoT+和exoY-4株，exoU-、exoS+、exoT-和exoY+28株，exoU-、exoS-、exoT+和exoY+2株，exoU-、exoS+、exoT+和exoY+29株，exoU+、exoS-、exoT-和exoY+2株，exoU+、exoS-、exoT+和exoY+2株，exoU+、exoS+、exoT+和exoY-2株，exoU+、exoS+、exoT-和exoY+5株，以及exoU+、exoS+、exoT+和exoY+8株。95株临床铜绿假单胞菌的毒力基因携带以exoU-、exoS+、exoT-、exoY+和exoU-、exoS+、exoT+、exoY+两种类型为主。痰液组中exoU-、exoS+、exoT+、exoY+基因型携带率33%，非痰液组为30%，exoU-、exoS+、exoT-、exoY+基因型在痰液组携带率为37%，在非痰液组携带率为22%。两种基因型携带率在痰液组和非痰液组均无统计学意义（p＞0.05）。Cq40、Cq1、Cq24及Cq16等四株临床菌株铜绿假单胞菌能侵入细胞，3μM穿心莲内酯就能显著降低侵入胞内的铜绿假单胞菌数： Cq1组菌落数由1840±121CFU/ml降至1090±101CFU/ml； Cq40组菌落数由2900±100CFU/ml降至1060±196CFU/ml； Cq16组菌落数由3200±264CFU/ml降至1090±125CFU/ml； Cq24组菌落数由1740±121CFU/ml降至980±190CFU/ml。当穿心莲内酯浓度增加至4.5μM时其抑制作用更强：Cq1组菌落数进一步减少至360±45CFU/ml；Cq40组菌落数减少至500±36CFU/ml；Cq16组菌落数减少至430±30CFU/ml；Cq24组菌落数减少至360±26CFU/ml。与此相应，铜绿假单胞菌感染所致的细胞LDH释放(3μM穿心莲内酯的作用)：Cq1组由3128.3±456.939μmol/ml下降至1875.8±16.061μmol/ml；Cq40组由4082.45±133.307μmol/ml下降至3175.266±298.927μmol/ml；Cq16组由3518.467±264.113μmol/ml下降至2131.6±178.922μ mol/ml； Cq24组由2382.4±63.161μ mol/ml下降至1636.466±55.930μmol/ml。穿心莲内酯浓度增加至4.5μM时，铜绿假单胞菌感染所致的细胞LDH释放进一步下降：Cq1组降至1061.366±165.731μmol/ml；Cq40组降至1813±92.528μmol/ml；Cq16组降至1459.7±137.157μmol/ml； Cq24组降至1016.133±77.309μmol/ml。在穿心莲内酯干预前后两者差异有统计学意义（p＜0.05），且两种不同浓度穿心莲内酯之间的作用强度差异有统计学意义（P＜0.05）。3μM穿心莲内酯干预后，IL-6的生成：Cq1组由25.133±0.204pg/ml降至17.557±0.318pg/ml；Cq40组由12.495±0.691pg/ml降至8.576±0.657pg/ml；Cq16组由15.130±0.449pg/ml降至10.780±0.982pg/ml；Cq24组由24.106±1.107pg/ml降至18.360±0.221pg/ml。IL-8的生成：Cq1组由593.866±48.981pg/ml降至372.466±3.2653pg/ml；Cq40组由472.5±48.350pg/ml降至339.6±5.556pg/ml；Cq16组由488.833±39.480pg/ml降至251.93±2.9004pg/ml；Cq24组由569.833±26.385pg/ml降至345.4±8.006pg/ml。当穿心莲内酯浓度增加至4.5μM时其抑制作用更强， IL-6的生成水平进一步下降：Cq1组降至8.865±0.175pg/ml；Cq40组降至3.761±0.209pg/ml；Cq16组降至3.348±0.341pg/ml；Cq24组降至8.833±0.574pg/ml。IL-8的生成水平也显著下降：Cq1组降至215.266±8.558pg/ml；Cq40组降至187.566±3.677pg/ml；Cq16组降至89.76±4.677pg/ml； Cq24组降至300.466±13.9004pg/ml。3μM穿心莲内酯使用前后铜绿假单胞菌炎症因子IL-6和IL-8的表达比较差异有统计学意义（P＜0.05）；4.5μM与3μM的穿心莲内酯的作用强度之间的比较差异也有统计学意义（P＜0.05）。 结论：临床铜绿假单胞菌对人支气管上皮细胞BEAS-2B具有侵袭力，使细胞LDH释放量增加以及刺激细胞表达大量炎症因子IL-6和IL-8；穿心莲内酯可抑制铜绿假单胞菌临床分离株对人支气管上皮细胞的侵袭力，并可降低细胞的损伤程度及改善细胞的炎症反应。
【关键词】：铜绿假单胞菌 Ⅲ型分泌系统 生物膜 人支气管上皮细胞 穿心莲内酯
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R378.99
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照5-6
• 摘要6-13
• ABSTRACT13-20
• 前言20-24
• 第一部分 临床铜绿假单胞菌生物膜形成的分析24-29
• 1 实验材料24-25
• 2 实验方法25-26
• 3 实验结果26-27
• 4 讨论27-29
• 第二部分 穿心莲内酯对临床铜绿假单胞菌感染人支气管上皮细胞的影响29-51
• 1 实验材料29-31
• 2 实验方法31-35
• 3 实验结果35-47
• 4 讨论47-51
• 全文总结51-52
• 参考文献52-57
• 文献综述57-67
• 参考文献61-67
• 致谢67-68
• 攻读硕士学位期间发表的论文68-69

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 王静;华子瑜;沈犁;张佳星;;穿心莲内酯对临床铜绿假单胞菌感染人支气管上皮细胞的干预研究[J];重庆医科大学学报;2013年10期

中国博士学位论文全文数据库 前2条

1 郭俏;铜绿假单胞菌致病因子抑制剂及喹诺酮信号分子介导的调节途径研究[D];西北大学;2013年

2 孔伟娜;铜绿假单胞菌中Ⅲ型分泌系统转录调控机制的研究[D];西北大学;2013年

  本文关键词：临床铜绿假单胞菌的毒力性能及穿心莲内酯对其的干预作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：302180