重组人白细胞介素-7及其剪接变异体蛋白的表达、复性和纯化

发布时间：2017-04-13 04:12

  本文关键词：重组人白细胞介素-7及其剪接变异体蛋白的表达、复性和纯化，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：白细胞介素-7（interleukin-7，IL-7）是一种多潜能的细胞因子，能促进B和T淋巴细胞生存、分化和增殖，在T细胞稳态调节中起关键作用，且能诱导CTL和巨噬细胞的细胞毒活性，因此，IL-7对T细胞耗竭的病人（如癌症、骨髓移植及AIDS）有非常好的治疗潜能。近年来人们在不同的肿瘤组织中发现了分子大小不同的IL-7剪接变异体（如IL-7-δ4、IL-7-δ4/5、IL-7-δ3/4等），推测其可能参与调节IL-7的生物活性。因此，本课题利用原核表达系统表达、复性和纯化重组人IL-7（recombinanthuman IL-7，rhIL-7）及其剪接变异体蛋白（rhIL-7-δ4、rhIL-7-δ4/5、rhIL-7-δ3/4），并利用免疫印迹技术对其进行鉴定，为其生物活性研究打下基础。 研究目的： 本课题在已经成功构建IL-7及其剪接变异体的原核表达载体pET21b-IL-7、pET21b-IL-7-δ4、pET21b-IL-7-δ4/5和pET21b-IL-7-δ3/4的基础上，表达、复性和纯化rhIL-7、rhIL-7-δ4、rhIL-7-δ4/5和rhIL-7-δ3/4蛋白，为其生物活性研究打下基础。 研究方法： ⒈rhIL-7及其剪接变异体蛋白的表达：对各保种菌重新进行PCR鉴定和测序鉴定后，测定生长曲线，以确定最佳IPTG诱导时机，并对各重组蛋白进行诱导表达和可溶性分析，优化IPTG诱导浓度和诱导时间，以确定最佳表达参数，SDS-PAGE分析表达产物。 ⒉rhIL-7及其剪接变异体蛋白的复性：各重组蛋白以包涵体形式表达后，通过梯度透析的方法复性，复性液A、B、C、D、E中分别含4、3、2、1、0M盐酸胍（Gu-HCl），并在复性关键步骤中加入L-精氨酸（L-Arg）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）和还原型谷胱甘肽（GSH）等复性辅助试剂以提高复性效率，采用BCA法测定蛋白液复性前后的浓度以计算各蛋白的复性效率。 ⒊rhIL-7及其剪接变异体蛋白的纯化和Western Blot鉴定：采用Ni2+亲和层析色谱法纯化各重组蛋白，上样后经Binding Buffer（30mM咪唑）洗脱非特异性结合的杂蛋白，再分别用Elution BufferA（60mM咪唑）、B（100mM咪唑）、C（300mM咪唑）进行梯度洗脱，分阶段收集洗脱液，SDS-PAGE、BandScan软件分析各蛋白纯度，BCA法测定纯化后的各蛋白浓度。分别以6×His小鼠单克隆抗体和鼠抗人IL-7抗体为一抗，辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠IgG为二抗对纯化后的各重组蛋白进行Western Blot鉴定。 结果： ⒈rhIL-7及其剪接变异体蛋白的表达：PCR扩增出的片段大小与预期的IL-7（531bp）、IL-7-δ4（399bp）、IL-7-δ4/5（345bp）、IL-7-δ3/4（318bp）一致，且测序结果与已报道的序列一致。rhIL-7、rhIL-7-δ4、rhIL-7-δ4/5、rhIL-7-δ3/4蛋白均能在大肠杆菌BL21(DE3)中获得良好表达，分别在17.4kDa、12.4kDa、10.3kDa、9.3kDa附近有一明显的条带，且均为包涵体形式表达。生长曲线分析和表达条件优化结果显示，rhIL-7、rhIL-7-δ4、rhIL-7-δ4/5、rhIL-7-δ3/4蛋白最佳诱导时机分别为：37℃、180rpm培养1.5h、2h、2.3h、1.8h；其最佳表达条件分别为（37℃、180rpm条件下培养）：1.0mM IPTG诱导2h、0.4mM IPTG诱导2h、0.6mM IPTG诱导3h、0.8mM IPTG诱导2h。 ⒉rhIL-7及其剪接变异体蛋白的复性：rhIL-7、rhIL-7-δ4、rhIL-7-δ4/5、rhIL-7-δ3/4蛋白的复性效率均较好，分别约为50%、48%、45%、65%，，且该复性方法重复性良好，可用于各重组蛋白的大量制备。 ⒊rhIL-7及其剪接变异体蛋白的纯化和Western Blot鉴定：SDS-PAGE、BandScan软件分析显示，各重组蛋白的纯化效果较好，其纯度均达到了95%以上，BCA法测定其纯化后的浓度均约为0.1mg/mL。以6×His小鼠单克隆抗体为一抗的Western Blot鉴定结果显示，rhIL-7、rhIL-7-δ4、rhIL-7-δ4/5、rhIL-7-δ3/4分别在17.4kDa、12.4kDa、10.3kDa、9.3kDa附近出现条带；以鼠抗人IL-7抗体为一抗的Western Blot鉴定结果显示，rhIL-7、rhIL-7-δ4分别在17.4kDa、12.4kDa附近出现条带，而rhIL-7-δ4/5、rhIL-7-δ3/4分别在10.3kDa、9.3kDa处没有条带；Western Blot鉴定结果与预期结果相符，表明各重组蛋白均获得有效表达。 结论： 本研究采用原核表达系统表达rhIL-7、rhIL-7-δ4、rhIL-7-δ4/5、rhIL-7-δ3/4蛋白，确定了最佳表达参数；经SDS-PAGE分析显示，各重组蛋白均为包涵体形式表达，经梯度透析法复性后，各重组蛋白的复性效率均较好，分别约为50%、48%、45%、65%；采用Ni2+亲和层析色谱法纯化后，各重组蛋白的纯化效果较好，其纯度均达到了95%以上，BCA法测定其纯化后的浓度均约为0.1mg/mL；经Western Blot鉴定结果显示，各重组蛋白均获得有效表达。因此，成功获得了高纯度的rhIL-7、rhIL-7-δ4、rhIL-7-δ4/5、rhIL-7-δ3/4复性蛋白，且该技术方法稳定性较好，有利于各重组蛋白的大量制备，为其生物活性研究打下了物质基础。
【关键词】：白细胞介素-7 剪接变异体 表达 复性 纯化
【学位授予单位】：广东药学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要6-9
• Abstract9-13
• 第一章 序言13-19
• 1.1 研究背景13-18
• 1.1.1 IL-7 的结构及来源13
• 1.1.2 IL-7 受体13
• 1.1.3 IL-7 的生物学活性13-14
• 1.1.4 IL-7 的应用前景14-16
• 1.1.5 IL-7 剪接变异体16-18
• 1.2 研究路线18-19
• 第二章 rhIL-7 及其剪接变异体蛋白的表达19-33
• 2.1 前言19
• 2.2 实验材料19-22
• 2.2.1 菌株和质粒19
• 2.2.2 主要试剂19
• 2.2.3 引物19
• 2.2.4 主要溶液配制19-22
• 2.2.5 主要仪器设备22
• 2.3 实验方法22-25
• 2.3.1 各重组原核表达质粒的鉴定22-23
• 2.3.2 各保种菌的生长曲线测定23
• 2.3.3 rhIL-7 及其剪接变异体蛋白的诱导表达和可溶性分析23-24
• 2.3.4 rhIL-7 及其剪接变异体蛋白的表达条件优化24-25
• 2.4 实验结果25-32
• 2.4.1 各重组原核表达质粒的鉴定25
• 2.4.2 各保种菌的生长曲线分析25-26
• 2.4.3 rhIL-7 及其剪接变异体蛋白的诱导表达和可溶性分析26-28
• 2.4.4 rhIL-7 及其剪接变异体蛋白的 IPTG 诱导浓度优化28-30
• 2.4.5 rhIL-7 及其剪接变异体蛋白的 IPTG 诱导时间优化30-32
• 2.5 讨论32-33
• 第三章 rhIL-7 及其剪接变异体蛋白的复性33-40
• 3.1 前言33
• 3.2 实验材料33-37
• 3.2.1 主要试剂33
• 3.2.2 主要溶液配制33-37
• 3.2.3 主要仪器设备37
• 3.3 实验方法37-38
• 3.3.1 rhIL-7 及其剪接变异体蛋白包涵体的洗涤和溶解37
• 3.3.2 rhIL-7 及其剪接变异体蛋白包涵体的稀释37-38
• 3.3.3 rhIL-7 及其剪接变异体蛋白包涵体的复性38
• 3.4 实验结果38-39
• 3.4.1 rhIL-7 及其剪接变异体蛋白包涵体的复性效率38-39
• 3.5 讨论39-40
• 第四章 rhIL-7 及其剪接变异体蛋白的纯化和 Western Blot 鉴定40-47
• 4.1 前言40
• 4.2 实验材料40-42
• 4.2.1 主要试剂40
• 4.2.2 主要溶液配制40-42
• 4.2.3 主要仪器设备42
• 4.3 实验方法42-43
• 4.3.1 rhIL-7 及其剪接变异体蛋白的纯化42
• 4.3.2 rhIL-7 及其剪接变异体蛋白的脱盐和保存42
• 4.3.3 rhIL-7 及其剪接变异体蛋白的 Western Blot 鉴定42-43
• 4.4 实验结果43-45
• 4.4.1 rhIL-7 及其剪接变异体蛋白的纯化43-44
• 4.4.2 rhIL-7 及其剪接变异体蛋白的 Western Blot 鉴定44-45
• 4.5 讨论45-47
• 全文总结47-48
• 研究展望48-49
• 参考文献49-57
• 攻读学位期间发表的论文57-58
• 附录 1 英文缩写语中文对照58-60
• 致谢60

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前9条

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本文编号：302769