利用毕赤酵母系统表达重组蛋白

发布时间：2021-02-16 07:05

　　毕赤酵母表达系统是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一。该系统操控简单、经济,表达量高,具有翻译后修饰的能力,不存在原核表达系统内毒素难以去除的问题,也不存在哺乳动物细胞表达系统的病毒和支原体污染问题。目前已有多种外源蛋白在该系统中成功表达。我们利用该系统表达了几种重组蛋白。 1.复合干扰素突变体 根据毕赤酵母密码子偏性合成了复合干扰素突变体基因,构建了分泌型酵母表达载体,线性化后转化GS115。在发酵罐中进行了高密度发酵,表达量为112mg/L,发酵上清经超滤、三步层析纯化获得纯度大于98%的重组蛋白,比活性大于6×10⁸IU/mg。 2.人干扰素-β1a 合成了人IFN-β1a基因,构建了酵母表达载体,线性化后转化GS115。甲醇诱导转化子,细胞病变抑制法测定诱导上清的抗病毒活性,培养上清中的表达量为2×10⁵IU/mL。 3.组织型纤溶酶原激活剂衍生物rPAm 构建了rPAm的酵母表达载体,并在毕赤酵母分泌表达,培养上清中的表达量为1.6mg/L。 4.Thr6-PDGF-BB 构建了Thr... 

【文章来源】：中国人民解放军军事科学院北京市

【文章页数】：53 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

发酵上清的SDS一APGE结果

图1.8发酵上清的SDS一APGE结果1诱导前的培养上清2，3诱导后的培养上清M低分子量标准蛋白图1.9三步层析纯化的SDS~PAGE结果1.SPXL洗脱峰经DTT处理PhenylS‘SuPerdexPeharoes洗脱峰经DTT处理75洗脱峰经DTI，处理4.低分子量标准蛋白5.PhenvlSPehoares洗脱峰经DTT处理6.SPuedrex75洗脱峰经DTT处理.25纯化产物的理化性质分析利用PE公司的491蛋白序列分析仪，采用自动Edmna降解法对毕赤酵母分泌表达的复合干扰素突变体的N端巧个氨基酸进行序列测定的结果为:CDLPQ一THLsG-NRRAL，与理论一致(图1.10)。说明酵母细胞对重组蛋白的N端剪切正确，该重组蛋白可用于临床用药。

复合干扰素突变体质谱测定图谱

【参考文献】：
期刊论文
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[3]两个新型多拷贝毕赤酵母表达载体的构建[J]. 齐连权,陈薇,于长明,来大志,翁少洁,王海涛.  军事医学科学院院刊. 2002(04)
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本文编号：3036389