病原细菌效应蛋白NIeB家族抑制死亡受体介导的细胞死亡机制的研究

发布时间：2021-02-16 04:16

　　肿瘤坏死因子家族在维持免疫平衡,控制细胞死亡和炎症反应中发挥着重要的作用。这些细胞因子被肿瘤坏死因子受体家族的蛋白识别,激活信号转导通路,形成死亡诱导的信号复合体（death inducing signalling complex, DISK）,促进细胞死亡。研究最为广泛的肿瘤坏死因子受体包括TNFR1/2, FAS和DR4/DR5,它们分别识别TNFa, FAS配体和TRAIL。死亡结构域所介导的自体或异体寡聚化对死亡诱导信号复合体的形成至关重要。它包括死亡受体自身或与其下游的接头蛋白TRADD或FADD之间的死亡结构域相互作用而形成寡聚复合体。NleB是肠致病性大肠杆菌（enteropathogenic Escherichia coli, EPEC）三型分泌系统的效应蛋白,在前人的研究中被认为具有抑制NF-κB信号通路的作用。本论文从此生物学现象入手,发现无论在细胞转染还是细菌感染水平,NleB都能非常有效地抑制肿瘤坏死因子（TNFa）激活的NF-κB炎症反应,而对白细胞介素（IL-1p）激活的NF-κB信号通路毫无影响。我们综合利用酵母双杂交,免疫共沉淀等生化手段,找到了NleB... 

【文章来源】：中国农业大学北京市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：109 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
目录
第一章 引言
    1.1 肠致病性大肠杆菌和肠出血性大肠杆菌的研究进展
        1.1.1 病原性大肠杆菌概述
        1.1.2 肠致病性大肠杆菌和肠出血性大肠杆菌的研究进展
    1.2 三型分泌系统和效应蛋白
    1.3 肠致病性大肠杆菌的非LEE效应蛋白
    1.4 病原菌和宿主细胞之间的相互作用
        1.4.1 细菌效应蛋白对宿主细胞骨架系统的影响
        1.4.2 细菌效应蛋白对宿主泛素化系统的影响
        1.4.3 细菌效应蛋白对宿主NF-κB和MAPK信号通路的影响
    1.5 死亡受体信号通路
        1.5.1 死亡受体家族的成员
        1.5.2 死亡受体信号的传导
第二章 材料方法
    2.1 分子生物学操作
        2.1.1 聚合酶链式反应
        2.1.2 限制性内切酶酶切反应
        2.1.3 琼脂糖凝胶电泳
        2.1.4 连接和转化
        2.1.5 定点突变
        2.1.6 质粒大提
        2.1.7 本论文中构建的基因和质粒总结
    2.2 细胞培养及转染
        2.2.1 细胞来源以及培养条件
        2.2.2 细胞转染
        2.2.3 稳定细胞系的建立
        2.2.4 SiRNA转染
    2.3 双荧光素酶报告实验
    2.4 免疫印迹、免疫共沉淀
        2.4.1 常用试剂配方
        2.4.2 免疫印迹
        2.4.3 免疫共沉淀
        2.4.4 本论文中使用的抗体总结
    2.5 p65蛋白的免疫荧光染色
    2.6 原核表达纯化重组蛋白
        2.6.1 常用试剂配方
        2.6.2 重组蛋白His-Sumo-NleB及其突变体的纯化
        2.6.3 重组蛋白GST-TRADD DD以及GST-FADD的纯化
    2.7 酵母双杂交实验
        2.7.1 实验中用到的培养基
        2.7.2 LiAc-介导的酵母转化
        2.7.3 酵母双杂交
        2.7.4 酵母DNA的提取
    2.8 肠致病性大肠杆菌的实验操作
        2.8.1 肠致病性大肠杆菌的培养
        2.8.2 肠致病性大肠杆菌的活化和感染
    2.9 细胞死亡的检测
第三章 实验结果与分析
    3.1 NleB抑制宿主细胞NF-κB信号通路的激活具有选择性
    3.2 NleB抑制多种TNF受体复合物下游的信号通路
    3.3 TRADD是NleB的结合蛋白
    3.4 NleB抑制TRADD DD寡聚进而抑制TNF受体复合物的组装
        3.4.1 NleB抑制TRADD过表达所激活的NF-κB和细胞死亡信号通路
        3.4.2 NleB抑制TRADD过表达所引起的自体或异体寡聚
        3.4.3 NleB抑制刺激条件下TNF受体复合物的组装
    3.5 极少量NleB即可以抑制TRADD DD自身寡聚以及与其他死亡受体结构域之间的结合
    3.6 NleB是一个细菌效应蛋白家族的成员
    3.7 NleB在体外是一个N-乙酰葡萄糖胺单糖转移酶
    3.8 NleB在体内是一个N-乙酰葡萄糖胺单糖转移酶
    3.9 NleB不是一个O-连接的N-乙酰葡萄糖胺单糖转移酶
    3.10 TRADD DD中第235位的精氨酸是NleB的修饰位点
    3.11 TRADD DD中第235位的精氨酸对TRADD功能很重要
    3.12 NleB能修饰多个含保守修饰位点的死亡受体或其接头蛋白
    3.13 NleB抑制多种死亡受体介导的细胞死亡
    3.14 细菌感染条件下NleB对死亡结构域蛋白糖基化的分析
    3.15 细菌感染条件下NleB对死亡受体信号通路的抑制作用
        3.15.1 细菌感染条件下NleB对TNF受体信号通路的抑制作用
        3.15.2 细菌感染条件下NleB对其他受体信号通路的抑制作用
    3.16 NleB糖基转移酶活性在动物感染模型中的研究
        3.16.1 鼠类柠檬酸杆菌中NleBc的生物学活性
        3.16.2 小鼠感染肠道定殖模型中NleB家族酶活功能的研究
第四章 讨论与展望
    4.1 实验结论
    4.2 讨论和展望
        4.2.1 关于精氨酸修饰的讨论
        4.2.2 关于课题意义的讨论和展望
参考文献
致谢
个人简历



本文编号：3036140