中东呼吸综合征冠状病毒S1蛋白的重组表达与免疫学功能研究

发布时间：2017-04-14 01:04

  本文关键词：中东呼吸综合征冠状病毒S1蛋白的重组表达与免疫学功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的: 中东呼吸综合征（Middle East Respiratory Syndrome，MERS）是由中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）感染引起的，这是一种新型高致病性冠状病毒。活病毒中和试验一直是检测血清抗体中和活性、评价抗体抗病毒作用的重要方法，但高致病病毒的活病毒中和试验需要高等级生物安全实验条件。为了克服MERS-CoV活病毒感染和中和试验在安全、效率等方面存在的诸多困难和不便，本研究建立了一种具有一次感染能力而无复制能力的MERS假病毒，它可以作为一种安全、有效的技术手段应用于MERS-CoV疫苗与抗体评价以及病毒致病机制研究。MERS-CoV S蛋白在介导病毒进入细胞中占据重要作用， S蛋白可以为MERS-CoV感染细胞提供结合位点。本研究重组表达的S1蛋白具有受体结合区，可以诱导机体产生中和抗体，诱导产生的中和抗体可以帮助MERS感染者抵抗病毒的再次入侵以及作为疫苗预防MERS-CoV的感染，S1蛋白可以为MERS-CoV致病机制研究以及新型抗病毒药物和疫苗的研发提供靶点。 方法: 将MERS-CoV S基因整合到载体pcDNA3.1中成为含有MERS-CoV S基因的重组质粒（pcDNA3.1-MERS-S），与缺失Env基因、含有荧光素酶报告基因的HIV-1骨架质粒（pNL4-3.Luc.RE）共同转染293T细胞，收获含有假病毒的上清。通过蛋白印迹、细胞感染实验和血清中和试验，确定是否成功包装出MERS假病毒，并能够有效应用于细胞感染与中和试验。 将MERS-CoV S1基因整合到真核表达载体pJW4303中成为含有MERS-CoV S1基因的重组质粒（pJW4303-MERS-S1），通过转染COS7细胞在上清中获得重组蛋白，经过纯化的重组蛋白作为包被抗原与MERS-CoV特异性抗体RBD-Fc进行ELISA检测从而确定重组表达的MERS-CoV S1蛋白是否具有抗原性。为了进一步确定重组蛋白S1是否具有免疫原性和免疫保护性，使用佐剂以皮下注射的方式免疫小鼠，于首次免疫后每三周免疫一次，共免疫三次，每次免疫后两周采集小鼠尾静脉血液，血清分离后通过流式细胞检测技术、假病毒系统及活病毒检测确定重组蛋白S1免疫血清是否具有中和活性。 结果: 成功包装出MERS假病毒pMERS-S，包装出的假病毒含有MERS-CoV S蛋白，并能够有效感染MERS-CoV敏感细胞系（HuH-7细胞）。MERS假病毒能够应用于抗体中和活性检测，在中和试验中被MERS-CoV中和抗体所中和而失去感染性。 构建的重组质粒pJW4303-MERS-S1成功的在COS7细胞中表达重组蛋白MERS-CoV S1，经Western blot鉴定正确，纯化后的重组蛋白免疫小鼠获得免疫血清，流式细胞检测技术的结果表明重组的MERS-CoV S1蛋白免疫血清可以成功阻断病毒RBD与受体细胞的结合，并且随着免疫血清稀释度的增加，这种中和作用逐渐减弱，假病毒中和实验及活病毒中和实验均表明，该免疫血清可以中和特异性的病毒，具有中和活性。 结论: 本研究建立了不依赖于BSL-3高等级生物安全条件的MERS假病毒系统，并有效应用于中和抗体检测，为MERS-CoV疫苗、药物评价及病毒致病机制研究提供了一种良好的技术支撑手段。本研究中，重组表达的S1蛋白可以与MERS-CoV特异性单抗发生抗原抗体反应，并且可诱导机体产生高滴度的抗体，进一步通过成功构建的假病毒系统、流式细胞术阻断实验及活病毒中和实验的验证，最终证明该重组蛋白诱导产生的抗体具有中和活性，说明S1在介导病毒与宿主细胞的结合上起到了至关重要的作用，它可作为疫苗预防MERS-CoV的感染，并且其诱导产生的抗体可以帮助MERS感染者抵抗病毒的再次入侵。因此，本研究重组表达的S1蛋白可以为MERS-CoV致病机制研究以及新型抗病毒药物和疫苗的研发提供靶点，从而使MERS防患于未然。
【关键词】：MERS-CoV 中和实验 假病毒 免疫保护性 疫苗
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R373.1
【目录】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-11
• 缩略词表11-13
• 前言13-15
• 第一部分 中东呼吸综合征冠状病毒假病毒系统的建立15-28
• 1 材料15-18
• 1.1 质粒、菌株及细胞15
• 1.2 MERS-CoV S 基因15-16
• 1.3 主要材料和试剂16
• 1.4 主要仪器设备16
• 1.5 主要试剂配方16-18
• 2 方法18-23
• 2.1 pMERS-S 的质粒构建18-21
• 2.2 假病毒的制备21
• 2.3 Western blot 鉴定重组质粒 pMERS-S 的表达21-22
• 2.4 MERS 假病毒感染力测定22
• 2.5 MERS 假病毒中和试验22-23
• 2.6 统计分析23
• 3 结果23-26
• 4 讨论26-28
• 第二部分 中东呼吸综合征冠状病毒 S1 蛋白的重组表达与免疫学功能研究28-43
• 1 材料28-30
• 1.1 质粒、菌株及细胞28
• 1.2 引物28
• 1.3 实验动物28
• 1.4 主要材料和试剂28-29
• 1.5 主要仪器设备29
• 1.6 主要试剂配方29-30
• 2 方法30-35
• 2.1 重组 pS1-PJW4303 质粒的构建30-32
• 2.2 质粒 pS1-PJW4303 的表达32-33
• 2.3 纯化蛋白的浓度测定33
• 2.4 ELISA 检测 MERS-CoV 受体结合区特异性小鼠单克隆抗体滴度33
• 2.5 动物免疫及血清收集33-34
• 2.6 ELISA 检测 MERS S1 血清抗体滴度34
• 2.7 流式细胞术检测免疫血清对病毒 RBD 与受体结合的阻断作用34
• 2.8 假病毒中和抗体检测34
• 2.9 活病毒中和抗体检测34
• 2.10 统计分析34-35
• 3 结果35-42
• 4 讨论42-43
• 结论43-44
• 参考文献44-48
• 综述48-53
• 参考文献51-53
• 致谢53-54
• 作者简介54-55

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 段昭君;谭文杰;鲁凤民;;中东呼吸综合征冠状病毒感染[J];中国病毒病杂志;2013年04期

  本文关键词：中东呼吸综合征冠状病毒S1蛋白的重组表达与免疫学功能研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：304847