以枯草杆菌芽孢呈递系统为基础的新型流感疫苗基础研究

发布时间：2017-04-14 04:12

  本文关键词：以枯草杆菌芽孢呈递系统为基础的新型流感疫苗基础研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:本研究利用枯草杆菌芽孢展示外源抗原的芽孢呈递技术，制备出表面展示流感病毒保守抗原M2蛋白胞外区（M2e）的重组芽孢，并作为流感病毒新型候选疫苗开展动物实验，，对其免疫原性及免疫保护效果进行分析与评价，为发展以枯草杆菌芽孢呈递系统为基础的新型流感疫苗奠定研究基础。 方法:（1）将枯草杆菌CotB基因构建到基因组整合质粒pDG1664中，再将3个串联的M2e分子基因连接到CotB基因的下游，构建成重组质粒pDG1664-CotB-M2e3；通过同源重组的方式，将外源基因CotB-M2e3整合到PY79枯草杆菌基因组中。利用红霉素抗性筛选重组菌并挑取重组子单菌落进行培养，提取基因组以PCR扩增和测序方式鉴定是否正确整合了M2e抗原基因；通过SDS-PAGE、Western Blot鉴定芽孢蛋白中流感病毒M2e抗原的表达情况，并采用流式细胞术和免疫荧光方法进一步确定M2e抗原在芽孢表面的表达。利用形态学观察、API CH50和API20E生化实验及16s rRNA分析等实验对重组芽孢的生长状态、生化特征等进行了分析和鉴定。（2）为了进一步分析表达流感M2e的重组芽孢的免疫原性和免疫保护性，我们应用表达流感M2e的重组芽孢进行动物免疫和动物攻毒实验。在不使用佐剂的情况下用重组芽孢直接口服免疫小鼠，首次连续口服免疫3天，待首次免疫4周后再连续免疫3天，之后于距首次免疫5周时进行末次免疫，分别在首次免疫后5、7、9、11、13、15、17周尾静脉采血并分离血清进行体液免疫反应的检测和分析；同时利用流式细胞术检测细胞免疫水平；通过攻毒保护性试验对这种新型候选疫苗进行免疫保护性评价。 结果：（1）表达流感病毒M2e的重组枯草杆菌芽孢的制备及鉴定：优化条件后，采用电转化方法将pDG1664-CotB-M2e3重组质粒转化至PY79感受态菌；转化菌经PCR检测和基因测序鉴定表明，重组芽孢基因组中正确整合了M2e抗原基因。重组芽孢经SDS-PAGE和Western Blot分析证实，流感病毒M2e抗原在重组芽孢中成功表达；采用流式细胞术和免疫荧光方法检测进一步确定了M2e抗原表达呈递在重组芽孢表面，形成的重组芽孢表面蛋白（CotB-M2e融合蛋白）分子量约为37kDa。实验研究表明，我们成功制备出整合了M2e基因重组枯草芽孢菌株（命名RSM2e31）。利用电子显微镜检测技术及重组芽孢传代培养，进行重组芽孢形态学观察和分析，实验结果表明重组菌株RSM2e31能与野生株一样形成芽孢，并且外源基因能够在重组杆菌芽孢中稳定存在；对重组芽孢菌进行的生化反应（API CH50及API20E）实验及16s rRNA测序结果分析表明，重组株仍属于枯草芽孢杆菌属。重组芽孢的生长状态如菌落形成和生化反应等虽然与野生枯草芽孢杆菌有稍许变化，但重组株的基本生化特性与野生株具有较好的一致性。 （2）表达流感病毒M2e的重组枯草杆菌芽孢免疫原性及免疫反应特征分析：为了进一步分析表达流感M2e的重组芽孢的免疫原性和观察其免疫反应特征，本研究采用口服免疫的方式免疫小鼠进行实验研究。小鼠免疫实验结果表明，RSM2e31重组芽孢不添加佐剂进行口服免疫能够诱导出良好的体液免疫应答，并且免疫后17周抗体水平处于较高的水平（1:11200）。抗体亚类分析表明重组芽孢诱导的IgG抗体以IgG1为主。进一步取免疫小鼠脾细胞进行的胞内细胞因子流式检测发现，RSM2e31重组芽孢免疫可以有效诱导M2e抗原特异性Th2型细胞免疫应答。小鼠肺和肠灌洗液sIgA检测发现，重组芽孢还能够诱导机体产生一定的粘膜免疫应答。 （3）表达流感病毒M2e的重组枯草杆菌芽孢疫苗的攻毒保护性实验研究：采用A/PR/8/34(H1N1)流感病毒以103TCID50剂量对免疫后17周小鼠进行攻毒保护性实验。野生株芽孢免疫组、PBS对照免疫组小鼠的存活率仅为10%，而RSM2e31重组芽孢免疫小鼠全部存活。肺组织病毒滴度检测发现，RSM2e31重组芽孢免疫小鼠肺组织病毒滴度显著降低，表明体内病毒复制得到有效抑制。由此可见，RSM2e31重组芽孢具有良好的免疫保护作用。 结论:本研究针对流感病毒M2e保守性抗原建立了枯草杆菌芽孢呈递技术方法，制备出在枯草杆菌芽孢表面稳定表达外源M2e蛋白的重组株。获得的重组芽孢免疫小鼠不仅诱导产生了有效地体液免疫反应和细胞免疫反应，也产生了粘膜免疫反应；表达流感病毒M2e的重组枯草芽孢疫苗免疫小鼠使其对病毒的感染产生了完全保护作用。该研究是对发展以枯草芽孢呈递系统为基础的新型口服流感疫苗的创新性探索，为其深入研究奠定了基础。
【关键词】：枯草杆菌 芽孢 流感 M2e 疫苗
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 缩略词表5-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-13
• 前言13-16
• 第一部分 表面展示流感病毒 M2e 抗原的枯草杆菌重组芽孢的制备及其生物学特征分析16-44
• 引言16-17
• 1 材料与方法17-28
• 2 结果28-42
• 3 讨论42-44
• 第二部分 表面展示流感病毒 M2e 抗原的枯草杆菌重组芽孢的免疫原性分析与免疫保护评价44-58
• 引言44-45
• 1 材料与方法45-48
• 2 结果48-55
• 3 讨论55-58
• 结论58-60
• 参考文献60-66
• 附录66-70
• 个人简历70-71
• 致谢71-72
• 综述72-80
• 参考文献78-80

【共引文献】

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 杜立新;苏云金芽胞杆菌cry8E基因转录调控机制研究[D];河北农业大学;2011年

  本文关键词：以枯草杆菌芽孢呈递系统为基础的新型流感疫苗基础研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：305183