白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白在白喉杆菌中表达及纯化体系的构建

发布时间：2017-04-14 09:03

  本文关键词：白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白在白喉杆菌中表达及纯化体系的构建，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：国内研制的结合疫苗的载体蛋白大多采用白喉毒素、破伤风类毒素、白喉无毒突变体CRM197蛋白,但由于白喉毒素、破伤风类毒素、均需要经甲醛脱毒处理得到,制备时需要对大量的毒素上清液进行处理,花费时间较长,而且脱毒后的类毒素存在毒性逆转的可能。CRM197蛋白是一种白喉毒素无毒突变体,不具有白喉毒素毒性,但具有良好的免疫原性和安全性,作为载体蛋白在国内外中应用广泛。本实验利用基因工程技术在白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae ATCC 27010)中对CRM197蛋白进行了表达,并对发酵,纯化工艺进行研究。在白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae ATCC 27010)中构建表达CRM197蛋白的重组质粒。在pK18mob-SacB载体上插入广谱复制起点,从而得到能够在白喉杆菌和大肠杆菌中穿梭复制的表达载体pCKM4.1;将完整的CRM197蛋白的表达基因插入此空载体pCKM4.1,得到游离于白喉杆菌染色体基因组外的稳定复制表达载体pCKM5.1,并通过接合转移的方法将其成功转化至白喉杆菌中以构建成基因工程菌株。表达产物经SDS-PAGE分析在58.0 kDa处可见清晰条带,Western blotting分析可见特异条带。对得到的基因工程菌株进行生产工艺摸索。通过接合转移转化至白喉杆菌(ATCC27010)中,载体上的导肽序列可以使得CRM197蛋白作为可溶性蛋白分泌到胞外表达,CRM197蛋白可占到菌体总蛋白的70%。同时加强对铁的调控,进一步优化培养基及发酵条件以提高产量。经过Q膜、硫酸铵沉淀、阴离子交换纯化步骤获得纯度达到95%的CRM197蛋白样品,大大的提高了蛋白得率,节约了纯化时间和成本。
【关键词】：结合疫苗 CRM197 接合转移 铁调控 阴离子柱
【学位授予单位】：天津科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392-33
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 1 前言9-15
• 1.1 结合疫苗概述9-11
• 1.1.1 结合疫苗产生9-10
• 1.1.2 结合疫苗的免疫机制10
• 1.1.3 结合疫苗的前景及存在问题10-11
• 1.2 结合疫苗中的常用载体11-12
• 1.2.1 结合疫苗中的常用载体概况11
• 1.2.2 结合疫苗中的常用载体分类11-12
• 1.3 CRM197蛋白作为蛋白载体在结合疫苗中的应用12-13
• 1.3.1 CRM197蛋白的分子生物学基础12
• 1.3.2 CRM197蛋白的应用及生产工艺开发12-13
• 1.4 本课题的研究目的、意义和主要内容13-15
• 1.4.1 本论文研究的目的和意义13-14
• 1.4.2 本论文研究的主要内容14-15
• 2 材料与方法15-39
• 2.1 实验材料15-22
• 2.1.1 菌种及质粒15
• 2.1.2 主要实验仪器15-16
• 2.1.3 工具酶及相关试剂16-17
• 2.1.4 培养基的配制及培养条件17-19
• 2.1.5 主要溶液19-22
• 2.2 主要分析方法22-25
• 2.2.1 核酸电泳方法22
• 2.2.2 DNA胶回收过程22
• 2.2.3 质粒小提试剂盒提取细菌质粒22-23
• 2.2.4 常规DNA PCR23
• 2.2.5 常用SDS-PAGE配制方法23-25
• 2.2.6 Western Blot免疫印迹25
• 2.2.7 层析柱装柱处理25
• 2.3 实验方法25-39
• 2.3.1 表达CRM197蛋白的基因工程菌株构建25-31
• 2.3.2 表达CRM197蛋白的基因工程菌株摇瓶水平上蛋白表达31-33
• 2.3.3 表达CRM197蛋白的基因工程菌株2L发酵罐水平上蛋白表达33
• 2.3.4 表达CRM197蛋白的基因工程菌株的发酵工艺33-35
• 2.3.5 CRM197蛋白的纯化工艺35-38
• 2.3.6 Western Blot对纯化后的CRM197蛋白定性研究38-39
• 3 结果与讨论39-55
• 3.1 表达CRM197蛋白的基因工程菌株构建39-43
• 3.1.1 表达CRM197蛋白的表达质粒的构建39-42
• 3.1.2 质粒pCKM5.1的电转化、质粒的接合转移42-43
• 3.1.3 质粒pCKM5.1中表达CRM197基因片段测序43
• 3.1.4 质粒pCKM5.1稳定性检测43
• 3.2 表达CRM197蛋白的基因工程菌株发酵工艺的摸索43-47
• 3.2.1 表达CRM197蛋白的基因工程菌株在摇瓶水平上蛋白表达量的鉴定43-44
• 3.2.2 表达CRM197蛋白的基因工程菌株在2L发酵罐水平上蛋白表达量的鉴定44-45
• 3.2.3 不同浓度Fe~(3+)对表达CRM197蛋白的基因工程菌株生长的影响45-46
• 3.2.4 氨基酸储液流加补料对表达CRM197蛋白基因工程菌株生长的影响46-47
• 3.3 CRM197蛋白纯化工艺的研究47-54
• 3.3.1 硫酸铵沉淀法粗纯CRM197蛋白不同浓度的选择47-48
• 3.3.2 Q SFF层析纯化工艺的摸索48-49
• 3.3.3 柱层析色谱法纯化CRM197蛋白不同填料的选择49-51
• 3.3.4 DEAE柱层析色谱法纯化CRM197蛋白条件优化51-52
• 3.3.5 CRM197蛋白纯化工艺总结52-54
• 3.4 表达CRM197蛋白的基因工程菌株发酵纯化后产物性质检测54-55
• 3.4.1 表达CRM197基因工程菌株的纯化产物Western Blot的定性研究54-55
• 4 结论55-56
• 5 展望56-57
• 6 参考文献57-64
• 7 攻读硕士学位期间发表论文情况64-65
• 8 致谢65-67
• 附录67-74

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 章跃陵;罗芸;彭宣宪;;血蓝蛋白功能研究新进展[J];海洋科学;2007年02期

2 欧阳晶,王健伟,屈建国,洪涛;白喉毒素DT_(386)片段的表达纯化及细胞毒性研究[J];中国生物工程杂志;2004年06期

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本文编号：305644