大肠杆菌脂多糖刺激RAW264.7细胞条件下CD40的作用机制

发布时间：2017-04-14 17:04

  本文关键词：大肠杆菌脂多糖刺激RAW264.7细胞条件下CD40的作用机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：白细胞分化抗原40(Cluster of differentiation antigen40, CD40)是一种重要的共刺激分子,异常表达会引发自身免疫炎症疾病。脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)本质上是一种糖蛋白,是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分,可以引发损伤性炎症反应,同时也是CD40基因表达的诱导物之一,可以上调RAW264.7细胞中CD40的表达。CD40的功能阐释可能为治疗炎症性疾病提供了新思路。 RNA干扰(RNAinterference, RNAi)可以使基因表达沉默,是研究特定基因功能及基因治疗的有力工具。本实验拟应用小干扰RNA(Small interfering RNA, siRNA)抑制LPS刺激条件下CD40的表达,应用蛋白印迹(Western blot)技术检测LPS刺激条件下siRNA对CD40表达的影响,应用酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA)、Western blot和Griess法分别检测其对细胞因子的分泌、诱导型一氧化氮合成酶(Inducible nitric oxide synthase, iNOS)蛋白的表达及一氧化氮的产生(Nitric oxide, NO)的影响。结果表明,在LPS刺激条件下,siRNA能有效的抑制CD40的表达。LPS刺激条件下,通过siRNA转染使CD40knockdown, RAW264.7细胞的白细胞介素-1β(Interleukin-1, IL-1β)、肿瘤坏死因子-α (Tumor necrosis factor alpha, TNF-a)和巨噬细胞炎症蛋白-2(Macrophage inflammatory protein-2, MIP-2)的分泌减少,诱导型一氧化氮合成酶(Inducible nitric oxide synthase, iNOS)蛋白的表达下调并且NO的产生减少。这些研究结果为治疗LPS介导的疾病提供了依据。
【关键词】：白细胞分化抗原40 小干扰RNA 脂多糖 细胞因子
【学位授予单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R363
【目录】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-9
• 文献综述9-17
• 1 脂多糖9-11
• 2 白细胞分化抗原40(CD40)11-15
• 2.1 CD40的结构及分布11
• 2.2 CD40在免疫反应中的作用11-13
• 2.3 CD40异常表达与疾病的发生发展13-15
• 3 RNA干扰15-17
• 3.1 RNAi的发现及作用机制15-16
• 3.2 RNAi的应用16-17
• 第一部分 siRNA有效抑制LPS刺激条件下的RAW264.7细胞CD40的表达17-37
• 1 前言17-18
• 2 材料与方法18-32
• 2.1 实验材料18-23
• 2.1.1 实验细胞18
• 2.1.2 主要试剂18-19
• 2.1.3 主要仪器19
• 2.1.4 主要溶液配制方法19-23
• 2.2 实验方法23-32
• 2.2.1 RAW264.7细胞的培养及LPS刺激23-25
• 2.2.2 RAW264.7细胞转染25-27
• 2.2.3 LPS刺激条件下siRNA转染RAW264.7细胞27
• 2.2.4 Western blot检测CD40蛋白表达27-31
• 2.2.5 数据分析31-32
• 3 实验结果32-35
• 3.1 未刺激和LPS刺激条件下RAW264.7细胞的形态观察32-33
• 3.2 siRNA的转染效率33
• 3.3 LPS刺激条件下siRNA knockdown RAW264.7细胞CD40蛋白的表达33-35
• 4 讨论35-37
• 4.1 LPS刺激与RAW264.7细胞CD40的表达35
• 4.2 siRNA转染35-37
• 第二部分 LPS刺激条件下CD40 knockdown对RAW264.7细胞3 种细胞因子的分泌和产生NO的影响37-58
• 1 前言37-39
• 2 材料与方法39-42
• 2.1 实验材料39
• 2.1.1 实验细胞39
• 2.1.2 主要试剂39
• 2.1.3 主要仪器39
• 2.1.4 主要溶液配制方法39
• 2.2 实验方法39-42
• 2.2.1 细胞上清的获取39
• 2.2.2 ELISA法检测细胞上清中的细胞炎症因子39-40
• 2.2.3 Western blot检测iNOS蛋白表达40-41
• 2.2.4 细胞上清中NO含量的检测41
• 2.2.5 数据分析41-42
• 3 实验结果42-55
• 3.1 LPS刺激条件下CD40 knockdown对RAW264.7细胞分泌IL-1β的影响42-45
• 3.1.1 LPS刺激浓度分析42-43
• 3.1.2 LPS刺激时间分析43-44
• 3.1.3 LPS刺激条件下CD40 knockdown对RAW264.7细胞分泌IL-1β的影响44-45
• 3.2 LPS刺激条件下CD40 knockdown对RAW264.7细胞分泌TNF-α的影响45-48
• 3.2.1 LPS刺激浓度分析45-46
• 3.2.2 LPS刺激时间分析46-47
• 3.2.3 LPS刺激条件下CD40 knockdown对RAW264.7细胞分泌TNF-α的影响47-48
• 3.3 LPS刺激条件下CD40 knockdown对RAW264.7细胞分泌MIP-2的影响48-51
• 3.3.1 LPS刺激浓度分析48-49
• 3.3.2 LPS刺激时间分析49-50
• 3.3.3 LPS刺激条件下CD40 knockdown对RAW264.7细胞分泌MIP-2的影响50-51
• 3.4 LPS刺激条件下CD40 knockdown对RAW264.7细胞iNOS蛋白表达的影响51-52
• 3.5 LPS刺激条件下CD40 knockdown对RAW264.7细胞产生NO的影响52-55
• 3.5.1 LPS刺激浓度分析52-53
• 3.5.2 LPS刺激时间分析53-54
• 3.5.3 LPS刺激条件下CD40 knockdown对RAW264.7细胞产生NO的影响54-55
• 4 讨论55-58
• 4.1 炎症细胞因子55-56
• 4.1.1 白细胞介素-1β55
• 4.1.2 肿瘤坏死因子α55-56
• 4.1.3 巨噬细胞炎症蛋白256
• 4.2 NO56
• 4.3 LPS刺激条件的选择56-58
• 全文结论58-59
• 参考文献59-66
• 缩略语表66-69
• 致谢69

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4 李，

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