结核分枝杆菌PPE37蛋白对RAW264.7巨噬细胞NF-κB、TNF-α、IL-6mRNA表达的影响

发布时间：2017-04-14 18:14

  本文关键词：结核分枝杆菌PPE37蛋白对RAW264.7巨噬细胞NF-κB、TNF-α、IL-6mRNA表达的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的结核分枝杆菌全基因组测序完成后，研究者发现PE和PPE家族基因占结核分枝杆菌编码区的10％，并且在致病分枝杆菌与非致病的分枝杆菌中存在差异表达。PPE家族中的PPE37蛋白同时位于结核分枝杆菌毒力有关的RD区。本论文研究PPE37蛋白在结核分枝杆菌感染机体过程中发挥的免疫调节机制。 方法1.利用生物信息学软件（uniprot、protparam、GOR4、SignaIP4.1、Bcepred、NetMHC3.2Server）分析PPE37蛋白的理化性质、二级结构及其B细胞/T细胞抗原表位等结构特征，从而预测PPE37蛋白在结核分枝杆菌感染机体过程中发挥的免疫调控机制。 2.根据Gene Bank中登录的ppe37基因序列（序列号BX842578），设计（primerpremier5软件）并合成其引物。利用基因工程技术构建重组克隆载体pEasy E2-ppe37，经PCR、双酶切、基因测序证实无误后，克隆至表达载体pET30a。重组表达载体pET30a-ppe37经IPTG诱导表达后，利用SDS-PAGE、Western blot分析其表达形式。利用Ni-NTA琼脂糖柱对表达蛋白进行纯化，并通过AlpHaImager2200软件分析其纯化率。 3.建立重组PPE37蛋白（浓度为100ng/mL、500ng/mL、5000ng/mL）刺激小鼠RAW264.7巨噬细胞模型，在24h、48h、72h分别收集细胞，提取总RNA，利用反转录引物反转录为cDNA。建立1000ng/mLLPS刺激巨噬细胞模型作为阳性对照组。利用基因工程技术构建细胞因子NF-κB、TNF-α、IL-6的标准质粒，并绘制标准曲线。利用Real-Time PCR检测上述各个组NF-κB、TNF-α、IL-6mRNA的表达量。 结果1.生物信息软件分析证实PPE37蛋白结构稳定、亲水性强、无信号肽。在线软件Bcepred显示PPE37蛋白的B细胞优势抗原表位区域为191-192；288-294；332-336；376-387。在线软件NetMHC3.2Server显示PPE37蛋白的T细胞优势抗原表位区域为0-9；144-153；156-165；239-248。这些结果证明PPE37蛋白在结核分枝杆菌感染机体过程中能被B细胞/T细胞识别，从而发挥免疫调控机制。 2.经PCR、双酶切、基因测序证实成功构建重组表达载体pET30a-ppe37。将其转化到E.coli BL21中，，经IPTG诱导，重组蛋白以包涵体的形式大量表达。利用AlpHaImager2200软件分析经Ni-NTA琼脂糖柱纯化后的重组蛋白纯化率为96.2%。 3.通过检测细胞因子NF-κB、TNF-α、IL-6mRNA表达量的变化，来观察PPE37蛋白对小鼠RAW264.7巨噬细胞的免疫学效应。浓度分别为100ng/mL、500ng/mL、5000ng/mL的重组蛋白刺激巨噬细胞，24h后Real-Time PCR检测结果显示与空白对照组相比NF-κB、TNF-αmRNA的表达没有影响（p0.05），而IL-6mRNA的表达上调（p0.05）；48h后NF-κB、TNF-α、IL-6mRNA的表达显著上调（p0.05）；72h后NF-κB、TNF-α、IL-6mRNA的表达显著上调（p0.05）。1000ng/ml LPS刺激巨噬细胞，24h、48h、72h均能使NF-κB、TNF-α、IL-6mRNA的表达显著上调（p0.05）。这些差异表达证实ppe37蛋白能引起的巨噬细胞免疫应答反应。 结论在结核分枝杆菌感染机体的过程中PPE37蛋白能够被B细胞、T细胞识别，从而发挥相应的体液免疫、细胞免疫反应。与此同时PPE37蛋白也可以通过调控细胞因子NF-κB、TNF-α、IL-6的表达引起巨噬细胞免疫应答反应。总之，PPE37蛋白在结核分枝杆菌感染机体的过程中发挥重要的免疫学效应。
【关键词】：结核分枝杆菌 PPE37蛋白 RAW264.7巨噬细胞
【学位授予单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R378.911
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 前言12-14
• 第一部分 PPE37 蛋白的生物信息学分析以及重组原核表达载体构建14-26
• 材料与方法14-22
• 实验材料14-15
• 实验方法15-22
• 实验结果22-26
• 第二部分 重组 PPE37 蛋白的原核表达与纯化26-33
• 材料与方法26-31
• 实验材料26-27
• 实验方法27-31
• 实验结果31-33
• 第三部分 重组 PPE37 蛋白与巨噬细胞相互作用的研究33-43
• 材料与方法33-38
• 实验材料33-34
• 实验方法34-38
• 实验结果38-43
• 讨论43-46
• 结论46-47
• 参考文献47-51
• 附录51-59
• 文献综述59-72
• 参考文献65-72
• 致谢72-73
• 攻读学位期间发表的学术论文73-74
• 个人简历74

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