内质网蛋白3参与自噬并影响胆固醇流出机制初探

发布时间：2017-04-15 00:10

  本文关键词：内质网蛋白3参与自噬并影响胆固醇流出机制初探，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：本研究以肝癌细胞HepG2为研究对象,探讨内质网蛋白3(Reticulon3, RTN3)与自噬的关系,并对RTN3参与细胞脂质代谢与胆固醇流出及其可能的机制做初步的探讨。 方法：(1)通过营养剥夺诱导细胞发生自噬,WB检测RTN3和自噬蛋白微管相关蛋白1轻链3B (microtubule-associated protein1light chain3B, LC3B)的蛋白水平,并调节RTN3表达水平检测Beclinl与LC3B的含量,激光共聚焦检测RTN3是否参与自噬泡形成。(2)免疫共沉淀检测RTN3是否与Bcl-2和Beclinl有相互作用,激光共聚焦检测它们是否有共定位。(3)不同浓度HDL和他汀刺激取样WB检测RTN3与LC3B表达变化,探讨RTN3是否参与调控相关脂质的代谢过程。(4)调节RTN3表达用油红O染色检测胞内脂质变化,并用胆固醇流出检测RTN3对胆固醇流出的影响。(5)调节RTN3表达并用WB检测RTN3与ABCA1表达变化,在HDL和他汀刺激下检测RTN3与ABCA1是否有共定位,初步探讨RTN3参与胆固醇流出机制。 结果：(1)营养剥夺诱导细胞自噬时,RTN3和LC3B均表达上调,上调RTN3表达则使LC3B明显增高;激光共聚焦实验发现LC3B和RTN3存在共定位。(2)免疫共沉淀和激光共聚焦结果表明RTN3与Beclinl存在相互作用。(3)随着HDL浓度增加,RTN3和LC3B均表达下调,他汀浓度增加时,RTN3和LC3B均表达上调。(4)油红O染色发现在RTN3高表达的细胞中脂滴数量下降,而RTN3低表达时脂滴在细胞内出现累积。当无HDL处理且RTN3高表达时胆固醇流出率高于RTN3低表达和正常组,在高浓度HDL诱导胆固醇流出时,RTN3高表达和低表达均抑制胆固醇流出。(5)在RTN3高表达和低表达时,ABCA1蛋白表达下降,并检测到ABCA1与RTN3共定位于胞内囊泡中。 结论：(1)RTN3与Beclinl相互作用影响HepG2细胞的自噬水平；(2)RTN3可通过调节自噬参与的脂质代谢；(3)RNT3影响细胞内脂滴数量和胆固醇流出。
【关键词】：RTN3 自噬 胆固醇流出
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R36
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 英文缩写注释11-12
• 1. 绪论12-20
• 1.1 内质网蛋白312-15
• 1.2 自噬15-20
• 1.2.1 自噬的分子机制16-17
• 1.2.2 自噬与脂质代谢17-20
• 2. RTN3参与细胞自噬20-44
• 2.1 材料20-24
• 2.1.1 实验试剂及耗材20-23
• 2.1.2 实验仪器设备23-24
• 2.1.3 软件24
• 2.2 实验方法24-31
• 2.2.1 细胞培养及实验分组24
• 2.2.2 细胞总蛋白提取24
• 2.2.3 细胞总蛋白定量24-25
• 2.2.4 Western Blot分析25-27
• 2.2.5 SDS碱裂解法制备质粒DNA27-28
• 2.2.6 RTN3表达调节28-29
• 2.2.7 细胞免疫荧光29
• 2.2.8 免疫共沉淀分析29
• 2.2.9 胆固醇流出实验29-30
• 2.2.10 油红O染色30
• 2.2.11 数据分析30-31
• 2.3 结果31-39
• 2.3.1 RTN3参与HepG2白噬31-34
• 2.3.2 调节RTN3表达对自噬的影响34-35
• 2.3.3 RTN3与LC3B的共定位35-36
• 2.3.4 RTN3与Bcl-2,Beclinl的相互作用36-37
• 2.3.5 RTN3与Beclinl的共定位37-39
• 2.4 讨论39-42
• 2.5 结论42-44
• 2.5.1 RTN3表达上调可促进自噬发生42-43
• 2.5.2 RTN3可能通过Beclinl影响自噬的发生43-44
• 3. RTN3对细胞胆固醇流出的影响44-58
• 3.1 材料44
• 3.2 实验方法44
• 3.3 结果44-53
• 3.3.1 调节RTN3的表达引起细胞内脂滴数量的变化44-46
• 3.3.2 RTN3影响细胞胆固醇平衡46-48
• 3.3.3 RTN3影响胆固醇流出的可能机制48-53
• 3.4 讨论53-57
• 3.5 结论57-58
• 3.5.1 RTN3可通过调节自噬参与脂质代谢57
• 3.5.2 RTN3可下调ABCA1影响脂质代谢57-58
• 4. 总结58-60
• 参考文献60-66
• 攻读学位期间主要的研究成果66-67
• 致谢67

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 李其岚,刘鑫,项荣,屈小玲,齐义鹏;HAP的凋亡诱发功能对其内质网定位的依赖性[J];中国生物化学与分子生物学报;2004年04期

2 张圣雪;邱龄;肖传实;方雅琴;李艳芳;;阿托伐他汀对血管内皮细胞自噬作用的影响[J];山西医科大学学报;2009年05期

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本文编号：307167