哺乳动物细胞展示型人源ScFv抗体库构建及靶向ErbB3 ScFv筛选

发布时间：2017-04-15 12:08

  本文关键词：哺乳动物细胞展示型人源ScFv抗体库构建及靶向ErbB3 ScFv筛选，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：抗体药物是目前研究和应用最为广泛的一类生物技术药物，是肿瘤、感染、炎症等疾病的重要治疗手段。全人源抗体药物因其免疫原性低，在迄今美国食品药品监督管理局（American Food and Drug Administration, FDA）批准上市的抗体类药物中（仅指含抗体可变区的抗体药物）占有很大的比重，已成为未来临床应用抗体发展的趋势。目前，全人源抗体候选序列主要通过噬菌体展示文库筛选获得，再改构到哺乳动物细胞中进行大量生产表达，这使“万里挑一”获得的抗体在从原核到真核的过程中面临很大的亲和力改变等风险。相比之下，基于哺乳动物细胞抗体库筛选出的候选抗体将原核表达系统筛选抗体具备的风险和弊端大大降低。目前，哺乳动物细胞抗体库技术报道有限，在国内外仍处于起步阶段，具有很大的学术意义和应用价值。本研究拟构建真核哺乳动物细胞展示型单链抗体（single—chain antibody fragment，ScFv）库，并选取表皮生长因子受体-3（v-erb-b2avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog3，ErbB3）为靶点进行ScFv抗体筛选以验证本抗体库的有效性。 第一部分构建真核哺乳动物细胞展示型ScFv抗体库。 本研究首先收集包括多种病种及健康志愿者在内共120例志愿者外周血淋巴细胞，通过提取总核糖核酸（Ribonucleic Acid，RNA）并反转录获得互补脱氧核糖核苷酸（complementary Deoxyribonucleic acid，cDNA），作为扩增人抗体库可变区基因的模板。参照文献设计28对简并引物扩增重链可变区，设计16对简并引物扩增轻链可变区。利用上述引物通过聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）扩增、胶回收分别获得重链抗体可变区（Heavy-chain variable region, VH）和轻链抗体可变区（Light-chain variable region,VL）库。通过重叠PCR，以(G4S)3的linker将VH及VL连接成单链抗体ScFv。通过Sfi I及Sal I双酶切位点将ScFv连接至载体pDisplay，构建重组质粒库pDisplay-ScFv。随机挑选质粒库pDisplay-ScFv单克隆并进行测序，并将VH及VL基因在IgBlast-IMGT数据库中进行比对，结果显示其均为有活性的人免疫球蛋白可变区基因，从而验证抗体库的有效性、多样性、库容量（pDisplay-ScFv质粒库的库容量约为107）。将质粒库瞬时转染到293T细胞中，培养60h后收细胞，利用ScFv蛋白C端带有的myc标签，用FITC标记的抗myc抗体对其进行流式分析实验，以确定该质粒库能够得到有效表达于细胞表面（结合转染效率，表达效率约为20%）。另外，还收集转染后24h的细胞，同样利用myc标签对其进行Western Blot实验，验证其抗体库表达蛋白大小的正确性（约为26kDa）。因此，，我们成功构建了一个具有一定多样性、有效性，并将ScFv抗体表达于哺乳动物细胞表面的展示型人源ScFv抗体库。 第二部分哺乳动物细胞展示型ScFv抗体库的验证 近期研究证明，酪氨酸激酶表皮生长因子受体家族成员之一的ErbB3，是表皮生长因子受体-1(epidermal growth factor receptor，EGFR/ErbB1)、表皮生长因子受体-2(v-erb-b2avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog2，ErbB2)抗体药物临床应用产生耐药性的关键因素，此外还直接参与介导多种ErbB3过表达肿瘤，如人骨肉瘤、黑色素瘤等的发生、恶化。以ErbB3为靶点的药物研发是近年的热点。在该部分研究中，我们拟基于前期构建的哺乳动物细胞表面的展示型人源ScFv抗体库，筛选ErbB3ScFv抗体以验证该抗体库的有效性和实用性。 首先构建ErbB3的胞外区（extracellular domain，ECD）蛋白及胞外配体结合区（receptor ligand-binding domain，RLD）蛋白用于筛选ScFv抗体。利用原核表达系统，将ErbB3的胞外区ECD基因和胞外配体结合区RLD基因分别构建至pET-28a(+)和pGEX-KG原核表达载体。通过菌液PCR、测序筛选阳性单克隆。将阳性单克隆转化到原核表达菌BL(DE3)中进行表达并纯化。将纯化后的ECD蛋白和RLD蛋白标记荧光素异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）；通过FITC标记的抗原蛋白利用流式细胞分选技术（Fluorescence Activated Cell Sorting,FACS）从文库中筛选靶向ErbB3的特异性抗体，并对其亲和力进行初步检测。 为验证实验设计的可行性，我们选取PubMed公布的ErbB3ECD ScFv（噬菌体抗体库中筛选获得）序列，并将其构建到pDisplay载体中构建重组质粒pDisplay-ErbB3ScFv并混入到质粒库中作为阳性对照。我们分别用10nM、2nM、0.8nM标记后蛋白进行三轮流式分选，每轮筛选30ml细胞，细胞密度为1×106/ml。第三轮筛选结束随机挑选单克隆测序，在测序得到的35个单克隆序列中，候选序列22号出现9次，候选序列31号出现5次，阳性对照及候选序列20号均出现3次，候选序列9号出现2次，其余均出现1次。之后利用流式细胞术对候选序列22号、候选序列9号及阳性对照进行初步亲和力测定，结果显示候选序列22号亲和力为0.72nM，候选序列9号亲和力为1.72nM，阳性亲和力为0.76nM。同时，在转染后60h，对候选ErbB3ScFv与细胞系A549中与细胞内源表达的ErbB3进行激光共聚焦共定位实验，结果显示细胞内源表达的ErbB3在细胞核、细胞质及细胞膜上均存在，外源蛋白ErbB3ScFv主要定位与细胞膜，与预期展示效果一致。 综上所述，本研究成功构建具有一定库容量、多样性及有效性的真核哺乳动物细胞展示型人源ScFv抗体库，并基于该抗体库成功筛选出具有一定亲和力的靶向人ErbB3胞外区的全人源ScFv抗体。本研究工作为后期筛选各种靶点、具有自主知识产权的人源ScFv抗体奠定基础。
【关键词】：全人源单链抗体 抗体库 表皮生长因子受体-3
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 英文缩略词表5-7
• 摘要7-10
• Abstract10-14
• 前言14-21
• 第一部分 哺乳动物细胞展示型人源 ScFv 抗体库的构建21-46
• 1 材料与方法21-35
• 2 结果35-43
• 3 讨论与小结43-45
• 4 小结45-46
• 第二部分 抗体库验证46-72
• 第一章 ErbB3 胞外区及胞外配体结合区构建、表达46-56
• 1 材料及方法46-52
• 2 结果52-54
• 3 讨论54-55
• 4 小结55-56
• 第二章 靶向 ErbB3 胞外区人源 ScFv 抗体的筛选56-72
• 1 材料与方法56-63
• 2 结果63-69
• 3 讨论69-71
• 4 小结71-72
• 全文总结72-74
• 参考文献74-80
• 本人简历80-82
• 致谢82-84
• 综述84-93
• 参考文献90-93

【参考文献】

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本文编号：308360