解耦联蛋白2对线粒体氧化损伤诱导端粒依赖性衰老的干预和机制

发布时间：2017-04-15 21:17

  本文关键词：解耦联蛋白2对线粒体氧化损伤诱导端粒依赖性衰老的干预和机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的： 本研究拟观察长期血管紧张素II（AngII）对人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）衰老的影响和相关机制，并进一步探讨高表达UCP2对细胞衰老、凋亡的影响和相关机制，以揭示UCP2在端粒依赖性衰老的作用。 方法： 1、用血管紧张素II（AngII），干预血清饥饿后的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）1周，并分为四组，①DMEM组；②AngII（0.1μmol/L）组；③AngII（1μmol/L）组;④AngII（10μmol/L）组。流式细胞仪法检测活性氧，线粒体膜电位和凋亡率，通过细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测各组衰老细胞数量（光学显微镜观察），通过Western blot检测各组细胞的TERT、UCP2、c-myc、c-fos、p65、p53、Akt、p-Akt、ERK和p-ERK蛋白的表达情况。 2、为了观察PI3K/Akt信号通路在氧化诱导细胞衰老机制中的作用，用血管紧张素II（AngII）干预血清饥饿后的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）前，通过LY294002(PI3K/Akt抑制剂)来抑制细胞的PI3K/Akt信号通路，并根据LY294002浓度不同，将实验组分为六组，ⅠDMEM组；Ⅱ AngII1μmol/L组；Ⅲ LY2940025μmol/L+AngII1μmol/L组；Ⅳ LY29400210μmol/L+AngII1μmol/L组；ⅤLY29400220μmol/L+AngII1μmol/L组；Ⅵ LY29400230μmol/L+AngII1μmol/L组。通过细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测各组衰老细胞数量（光学显微镜观察）。通过Western blot检测各组细胞的TERT、UCP2、c-myc、c-fos、p65、p53、Akt、p-Akt、ERK和p-ERK蛋白的表达情况。 3、用血管紧张素II（AngII）和拟高表达解耦联蛋白2（UCP2）作用的外源性解偶联剂CLCCP，干预血清饥饿后的HUVECs1周，将实验分组设为⑴DMEM组；⑵AngII（1μmol/L）组；⑶CLCCP(10μmol/L)+AngII（1μmol/L）组；⑷AngII（1μmol/L）+DMSO组。通过上述相同的方法检测各组活性氧、线粒体膜电位、凋亡率和衰老细胞水平。通过Western blot检测各组细胞的TERT、Akt、p-Akt、ERK和p-ERK蛋白的表达情况。 结果： 1、AngII（10μmol/L）组，AngII（1μmol/L），AngII（0.1μmol/L）组，DMEM组在干预一周后检测ROS水平分别为1595±16.7、1312±14.3、1096±13.8、943±12.3(各组间比较P均0.01)；线粒体膜电位水平分别为948±13.2、826±11.8、652±9.9、298±6.1(各组间比较P均0.01)；各组凋亡率（Annexin V-FITC）分别为50.01±5.9、31.4±1.5、22.2±3.2、15.8±2.0(各组间比较P均0.01)；β-半乳糖苷酶染色的衰老细胞随着AngII浓度的升高而增多；随着AngII浓度的增高，TERT、UCP2、P-ERK、P-Akt、c-myc、c-fos、P53、P65的表达水平都有所升高，都要显著高于对照组,P65在高水平AngII干预下表达明显升高。 2、随着PI3K/Akt抑制剂LY294002的浓度的升高，，各组细胞染色情况我们可以看出，细胞数明显减少，染色衰老的细胞逐渐的减少；通过LY294002抑制PI3K/Akt通路后，p-Akt、TERT、UCP2、c-fos、p65、c-myc、p53的表达显著降低，在高浓度LY294002时AKt的表达量也有所降，P-ERK的表达与LY294002浓度具有正相关性，且差异很显著。 3、线粒体解耦联组的ROS水平（1123±12.5）要低于AngII组（1258±13.6，p＜0.01）；线粒体解耦联组的膜电位水平（626±9.8）要低于AngII组（835±12.2，p＜0.01）；线粒体解耦联组的凋亡率（21.45±1.8）要低于AngII组（32.2±1.6，p＜0.01）；线粒体解耦联组通过β-半乳糖苷酶染色的衰老细胞要明显少于AngII组；Western blot下，线粒体解耦联组相对于AngII组，TERT、P-Akt、P-ERK的表达水平明显增加。 结论： 1、长期的氧化损伤下可以诱导细胞衰老和凋亡，外源性UCP2可以降低线粒体膜电位水平和ROS水平，抑制细胞的衰老和凋亡，其过程涉及PI3K/Akt信号通路，ERK信号通路和TERT的高活性。 2、依赖ROS的PI3K/AKt增殖信号促进细胞衰老。 3、ROS能激活PI3K/Akt和ERK信号途径通路，P65、c-myc、c-fos、TERT和UCP2位于PI3K/Akt通路作用的下游，它们可能是氧化损伤下抗衰老和凋亡的重要通路和生存因子。
【关键词】：衰老 端粒 解耦联蛋白2 氧化应激 线粒体
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 缩略词对照表10-11
• 第1章 引言11-13
• 第2章 材料和方法13-23
• 2.1 实验材料13-22
• 2.1.1 细胞株来源13
• 2.1.2 主要实验仪器13
• 2.1.3 主要实验试剂13-14
• 2.1.4 自配试剂14-16
• 2.2.1 人脐静脉内皮细胞培养16-18
• 2.2.2 人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的处理18-19
• 2.2.3 检测指标与方法19-22
• 2.3 统计学分析22-23
• 第3章 实验结果23-36
• 3.1 血管紧张素 II 对线粒体活性氧和膜电位的影响23-24
• 3.2 血管紧张素 II 对凋亡率的影响24-25
• 3.3 血管紧张素 II 对细胞衰老的影响25-26
• 3.4 血管紧张素 II 对 HUVEC 中 TERT、UCP2、ERK、AKt、p-ERK、p-Akt、c-myc、c-fos、p53、p65 蛋白表达水平的影响26-27
• 3.5 不同浓度 PI3K/AKT 抑制剂对 HUVECs 衰老细胞β-半乳糖苷酶的染色影响27-29
• 3.6 不同浓度 PI3K/AKT 抑制剂对 HUVECs 中 TERT、UCP2、ERK、AKt、p-ERK、p-Akt、c-myc、c-fos、p53、p65 蛋白表达水平的影响29-30
• 3.7 线粒体解耦联对血管紧张素 II 处理下的 HUVECs 活性氧和膜电位的影响30-32
• 3.8 线粒体解耦联对血管紧张素 II 处理下的 HUVECs 凋亡率的影响32-33
• 3.9 线粒体解耦联对血管紧张素 II 处理下的衰老细胞β-半乳糖苷酶的染色影响33-34
• 3.10 线粒体解耦联对 TERT、ERK、AKt、p-ERK、p-Akt 蛋白表达水平的影响34-36
• 第4章 讨论36-41
• 4.1 PI3K/AKT 和 ERK 信号通路与细胞衰老36
• 4.2 活性氧和 p53 对细胞衰老和凋亡的影响36-37
• 4.3 PI3K/AKT 和 ERK 信号通路与 UCP2 等生存因子在端粒依赖性衰老中作用37-38
• 4.4 UCP2 对端粒依赖性衰老的影响38-39
• 4.5 UCP2 在端粒依赖性衰老的作用机制39-41
• 第5章 结论41-42
• 致谢42-43
• 参考文献43-47
• 攻读学位期间的研究成果47-48
• 综述48-56
• 参考文献54-56

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本文编号：309278