抗人MASP2-C蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

发布时间：2017-04-15 22:06

  本文关键词：抗人MASP2-C蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：对病原体是否易感取决于机体的抵抗力,而天然免疫是抵御病原体入侵的第一道防线。近年来天然免疫研究迅速崛起,提示从天然免疫的角度审视感染性疾病及其防治,可能会有意外收获。补体激活的第三条途径——凝集素途径为天然免疫系统中的重要成分,而甘露聚糖结合凝集素(mannan-binding lectin, MBL)相关丝氨酸蛋白酶2(MBL-associated serine protease2, MASP2)是其关键蛋白酶。 MASP2与Clr、Cls同属丝氨酸蛋白酶超家族[2],在血浆中以酶原形式存在。已发现MASP家族3个丝氨酸蛋白酶：MASP1、MASP2、MASP3,以及2个非酶蛋白：MAp19、MAp44;其中MASP2、MAp19是同一基因的差异剪切产物,MASP1、MASP3及MAp44也来源于同一基因的不同剪切；五者均可与MBL形成大分子复合物(MBL-MASPs)。MASP2分子为单肽链,从N端至C端由6个功能区组成,依次为：CUB区(complement subcomponent CIr/C1s-like domain)、EGF区(epidermal growth factor-like domain)、CUB区、2个CCP区(complement control protein domain)、SP区(serine proteases)。研究表明,MASP蛋白N端及C端的功能相对独立:MASPN端的3个结构域即2个CUB区和1个EGF区是MASP与MBL-CLR结合的区域,能以Ca2+依赖方式与MBL相互作用,形成MBL-MASPs复合物；而C末端的3个结构域即2个CCP区和1个SP区是丝氨酸蛋白酶的活性中心,激活补体主要依靠SP区发挥丝氨酸蛋白酶的作用,裂解补体C4和C2,产生C3转化酶。 在凝集素途径中,MBL/纤维胶原素与MASP1/MASP2等组成类似C1的复合物,前者通过CRD识别并结合病原微生物表面的甘露糖、N-乙酰葡萄糖等相应糖结构后,后者相继被激活,活化的MASP2裂解补体C4和C2形成C3转化酶C4b2a,由此形成补体激活凝集素途径。故MASP2为MBL和几种(H、M和L)纤维胶原素激活补体所必需,在凝集素途径中发挥至关重要的作用。 近来研究表明,血清MASP2含量的变化与感染性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病等多种疾病密切相关。MASP2基因GAC120GGC点突变导致编码产物由天冬氨酸(Asp)变为甘氨酸(Gly),该点突变位于CUB1结构域,可引起血清MASP2浓度降低或缺失,且突变MASP2蛋白与MBL及纤维胶原素的结合力降低,使免疫识别复合物分离,导致不能激活凝集素途径,从而引起或加重病原体的感染。已有研究表明,血清MASP2水平是预测结直肠癌复发、存活时间的独立标志；其也与食管鳞状细胞癌的进展以及肿瘤的侵袭性密切相关。此外,MASP2基因多态性也与HCV易感性相关,HCV患者血清中MASP2浓度增高。 现有资料表明,不同地域、不同种族人群,其MASP2基因不同位点存在的点突变具有明显差异,突变频率、血清水平也存在差异。而目前国内并无中国人或各民族MASP2血浆浓度、与天然免疫及相关疾病的关系较全面的报道。 由于MASP2具有上述重要作用,有必要对其进一步深入研究,而MASP2单克隆抗体(单抗)便是重要的工具之一。本研究以纯化的重组人MASP2-C蛋白为抗原,制备了特异性识别人MASP2-C端蛋白的单克隆抗体,通过Western Blot、ELISA证实单抗特异性好,灵敏度高,具有一定的生物学功能。而关于人血浆MASP2浓度的测定方法,目前国内未见相关报道,本研究利用抗MASP2-C单抗及多抗,建立双单抗、单多抗及多单抗夹心ELISA法检测人血浆MASP2浓度,筛选并优化最佳体系,初步可用于检测人血浆MASP2浓度。本研究为深入探讨MASP2的生物学作用及MASP2缺损有关疾病的诊断提供了有效的工具和手段。 第一章MASP1、MASP2C端蛋白的原核表达及鉴定 MASP2在人血清中含量较低,普通人群在1μg/ml以下；并与MASP1、 MASP3、sMAp、MBL等共同存在于MBL-MASPs复合物中。因此,从血浆中获取高纯度的天然MASP2蛋白困难较大。鉴于此,我们采用分子生物学技术,应用原核表达系统来获得目的蛋白。MASP2在血浆中以酶原形式存在,在体内及体外操作过程中可以自动激活,不利于后续实验的进行；考虑到MASP2N端和C端的不同结构域的功能相对独立,我们采用分段表达的策略来制备MASPl-C、MASP2-C蛋白。 我们以含人MASP1、MASP2全长编码区cDNA的pGEM-MASP1、 pGEM-MASP2质粒为模板,设计引物,扩增出人MASP1和MASP2的C端基因片段,将其分别克隆至pET-17b质粒中,经PCR及基因测序鉴定序列正确后,导入大肠杆菌BL21(DE3),在氨苄青霉素抗性的筛选培养基上获得了表达目的基因的pET17b-MASP1C和pET17b-MASP2C重组大肠杆菌,以IPTG诱导其表达MASP1-C/His、MASP2-C/His融合蛋白,经SDS-PAGE鉴定证明融合蛋白存在于包涵体中。对以包涵体形式存在的MASP1-C/His、MASP2-C/His融合蛋白经8mol/L尿素变性后再行递减尿素浓度梯度复性,获得结构折叠正确的重组蛋白,ELISA鉴定其能与抗His抗体特异性结合。将重组蛋白经Ni2+-NTA agarose层析柱纯化,获得了纯化的MASP1-C和MASP2-C融合蛋白。 第二章特异性识别MASP2-C单克隆抗体制备和鉴定 以纯化的重组MASP2-C蛋白为抗原,将其与等体积佐剂充分乳化,免疫6只BALB/c小鼠,免疫3次后以间接ELISA法测血清抗体效价达1.0×105以上时,即可取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(NS-1)融合,按常规方法制备杂交瘤。以MASP2-C为抗原包被酶标板,并以带His标签的无关蛋白(CLR/His)做抗原进行平行筛选。间接ELISA、Western blot对各抗MASP2-C单抗进行特异性鉴定分析。结果总计获得15株可能分泌抗MASP2-C单抗的杂交瘤细胞,经抗体亚类(型)鉴定,15株单抗均为IgGl类,轻链为κ链。所获杂交瘤细胞株扩大培养后注射至BALB/c小鼠腹腔制备腹水,用辛酸-硫酸铵沉淀法从腹水中纯化抗体。 间接ELISA结果显示除单抗2B11、2B3与MASP1-C、MASP2-N存在交叉反应外,其余13株抗体均只与MASP2-C反应,与CLR/His无反应；SDS-PAGE及Western blot显示：除在目的位置处有特异性条带外无其他杂带,表明单抗特异性良好。我们选取单抗1D1、4C11、2C11、3G4进行功能试验：通过分析MBL-MASPs复合物与甘露聚糖结合的方法来检测单抗与血浆MBL-MASPs复合物中天然MASP2的结合活性及通过C4b沉积实验检测mAb对补体凝集素途径阻断活性[13],二者分别提示单抗1D1、4C11、2C11、3G4与血浆中天然MASP2结合活性好,并能通过抑制MASP2裂解C4而阻断补体凝集素途径。 第三章建立双抗体夹心ELISA检测血浆MASP2浓度 我们已获得了15株抗MASP2-C的单克隆抗体,为了建立敏感的双抗体夹心体系来检测血浆MASP2蛋白,我们又以纯化的重组MASP2-C蛋白为免疫原,免疫新西兰兔获得兔抗人MASP2-C多克隆抗体；并选择将单抗2B11、3D4、5A1、4C8标记生物素。然后分别以多单抗、单多抗夹心、双单抗夹心ELISA方法检测MASP2-C,从多种配对方法中筛选出阳性值较高、阴性值较低、并对血浆天然MASP2敏感的最佳配对,对此配对进行了体系的优化。结果表明：在抗体包被浓度为1μg/ml,封闭液为0.25%酪蛋白,洗液为0.5%oPBST,标准品稀释液为PBS,检测抗体浓度为0.5μg/ml时即可良好检测标准品及血浆样本中的MASP2,在此条件下建立的标准曲线拟合度、可重复性均较好,检测范围在10-1500ng/ml,符合临床检测的需要。
【关键词】：MASP2-C 单克隆抗体 ELISA 血清MASP2浓度
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-13
• 前言13-16
• 第一章 人MASP2-C蛋白的原核表达及鉴定16-30
• 1.1 材料和方法16-25
• 1.2 结果25-28
• 1.3 讨论28-30
• 第二章 抗MASP2-C蛋白单克隆抗体的制备和鉴定30-47
• 2.1 材料和方法30-38
• 2.2 结果38-45
• 2.3 讨论45-47
• 第三章 建立双抗体夹心ELISA检测血浆MASP2浓度47-62
• 3.1 材料与方法47-52
• 3.2 结果52-60
• 3.3 讨论60-62
• 全文总结62-64
• 参考文献64-69
• 中引文缩略词69-71
• 在读期间发表的文章71-72
• 致谢72-74

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