新型重组猪α-干扰素的制备及其活性分析

发布时间：2017-04-16 02:15

  本文关键词：新型重组猪α-干扰素的制备及其活性分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：干扰素是机体在一系列诱导因素的作用下，产生的一类具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节功能的细胞因子。从1957年Isaacs和Lindenmann发现至今，已有很多关于干扰素的研究报道，其中大多数是着重于干扰素的规模化生产研究，以满足在疾病治疗方面的需求。IFN作为动物体内所知作用最快的第一道防御体系，对病毒性疾病的治疗起到极其重要的作用。但是IFN机体自身表达量较低，无法满足防治疾病的要求。所以利用基因工程技术，体外大规模获得IFN十分必要。目前所知的干扰素表达系统有大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、动物细胞表达系统和植物表达系统。其中大肠杆菌表达系统目前研究较为深入，具有培养条件简单，操作容易，培养周期短，成本低，产量高，易于规模化等有优点。不足之处是其表达的蛋白常以包涵体的形式存在。本实验，构建了pET32-PoIFNα/BL21(DE3)重组菌株，并可溶性的表达出了PoIFNα。纯化，WB鉴定后，进行了生物活性测定，结果表明具有较好的抗病毒活性。主要结果如下： 根据GeneBank中报道的猪α干扰素基因序列（M28623），设计一对引物。以猪肝脏基因组DNA为模板，PCR扩增出猪α干扰素成熟肽基因。克隆到pET32质粒中，构建了重组质粒pET32α-PoIFNα。经PCR鉴定，双酶切鉴定和测序鉴定后，转化入BL21（DE3），，筛选得到含表达质粒的基因工程菌pET32-PoIFNα/BL21(DE3)。 诱导重组菌株表达，产物经SDS-PAGE蛋白电泳分析，在3.8×104的位置出现了目的蛋白条带，与预期相符。并且，通过还原上样缓冲液和非还原上样缓冲液两种方法处理样品，证明表达蛋白是以有活性的单体形式存在的。经过温度、IPTG、诱导时间的摸索，确定了可溶性表达的最佳条件为22℃、0.5mM IPTG、诱导10h。在最佳条件下，大规模诱导工程菌，表达产物经镍柱亲和层析纯化，得到了纯度较高的重组蛋白。WB鉴定，进一步证实了表达产物确实为PoIFNα。纯化产物透析除盐后冻干，4℃冰箱保存。 使用干扰素预处理Marc145细胞，然后用100CCID_(50)的PRRSV攻击，结果表明，PoIFNα具有抗病毒活性。为下一步PoIFNα的开发奠定了基础。
【关键词】：猪干扰素α pET32α 基因工程药物 基因重组
【学位授予单位】：重庆理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 第一章 绪论10-20
• 1.1 猪 IFN-α的研究进展10-16
• 1.1.1 猪干扰素研究概况10
• 1.1.2 猪α干扰素作用机制10-11
• 1.1.3 猪α干扰素生物活性11-13
• 1.1.4 基因工程猪 IFNα的研究进程13-14
• 1.1.5 猪α干扰素在临床应用14-15
• 1.1.6 猪α干扰素的前景展望15-16
• 1.2 课题研究意义及其立项依据16-17
• 1.3 研究内容及其技术路线17-20
• 1.3.1 研究内容和方法17-18
• 1.3.2 技术路线18-20
• 第二章 pET32a-PoIFNα基因工程菌的构建20-32
• 2.1 实验材料20-22
• 2.1.1 载体与菌株20
• 2.1.2 工具酶及其他20
• 2.1.3 主要仪器20
• 2.1.4 主要试剂的配置20-22
• 2.2 实验方法22-26
• 2.2.1 引物设计22
• 2.2.2 猪肝脏基因组 DNA 的提取22
• 2.2.3 猪α-干扰素成熟肽基因的克隆22-23
• 2.2.4 DNA 电泳23
• 2.2.5 目的片段的回收23-24
• 2.2.6 质粒的提取24
• 2.2.7 质粒和 PCR 产物的双酶切24-25
• 2.2.8 DNA 片段的连接25
• 2.2.9 感受态细胞的制备25
• 2.2.10 感受态细胞的转化25-26
• 2.2.11 阳性克隆的鉴定26
• 2.3 实验结果26-30
• 2.3.1 猪肝脏基因组 DNA 提取和 IFN-α成熟肽基因扩增结果26-27
• 2.3.2 重组 pET32a-IFN-α质粒的鉴定27-28
• 2.3.3 重组质粒 pET32a-IFN-α基因测序结果与分析28-30
• 2.4 本章讨论30-32
• 2.4.1 重组 pET32a-IFN-α质粒的设计30
• 2.4.2 重组 pET32a-IFN-α质粒的构建30
• 2.4.3 重组 pET32a-IFN-α质粒的鉴定30-32
• 第三章 工程菌的诱导表达及其产物纯化32-48
• 3.1 实验材料32-35
• 3.1.1 重组基因工程菌32
• 3.1.2 实验耗材与仪器32-33
• 3.1.3 主要试剂及其配制33-35
• 3.2 实验方法35-41
• 3.2.0 pET32a-IFN-α/BL21(DE3) 重组菌株的诱导表达35-36
• 3.2.1 IFN-α可溶性表达的诱导条件优化36-38
• 3.2.2 pET32a-IFN-α/BL21(DE3) 重组菌株的大量诱导表达38
• 3.2.3 IFN-α的纯化38-39
• 3.2.4 分子鉴定39
• 3.2.5 IFN-α冻干粉的制备39-40
• 3.2.6 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量40-41
• 3.3 实验结果41-45
• 3.3.1 pET32a-IFN-α/BL21(DE3) 重组菌株可溶性分析及其优化41-43
• 3.3.2 猪 IFNα纯化结果43
• 3.3.3 分子鉴定43
• 3.3.4 蛋白含量测定43-45
• 3.4 本章讨论45-48
• 3.4.1 猪 IFN-α可溶性表达的诱导条件优化45
• 3.4.2 猪 IFN-α的纯化45-46
• 3.4.3 蛋白浓度测定方法46-48
• 第四章 猪 IFN-α活性测定48-56
• 4.1 实验材料48-49
• 4.1.1 实验细胞和病毒48
• 4.1.2 实验耗材与仪器48
• 4.1.3 主要试剂的配制48-49
• 4.2 实验方法49-51
• 4.2.1 Marc145 细胞的培养49-50
• 4.2.2 PRRSV 病毒的增殖50
• 4.2.3 PRRSV 的 CCID_(50)测定50-51
• 4.2.4 猪 IFN-α的活性测定51
• 4.3 实验结果51-53
• 4.3.1 Marc145 细胞的培养与 PRRSV 病毒的增殖51-52
• 4.3.2 CCID_(50)测定结果52
• 4.3.3 猪 IFN-α活性测定结果52-53
• 4.4 本章讨论53-56
• 4.4.1 Marc145 细胞的培养53
• 4.4.2 干扰素活性测定方法53-56
• 第五章 全文总结及后续工作建议56-58
• 5.1 全文总结56
• 5.2 不足之处56
• 5.3 后续工作计划56-58
• 致谢58-60
• 参考文献60-64
• 附录64-66
• 附录 1 Reed-Muench 两氏法64
• 附录 2 细菌结晶紫染色法64-65
• 附录 3 细胞计数法65-66
• 英文缩写索引66-68
• 个人简历、在学期间发表的学术论文及取得的研究成果68

【参考文献】

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本文编号：309778