去泛素化酶USP26基因的2个无义突变及6个错义突变对其酶活性的影响

发布时间：2017-04-16 08:27

  本文关键词：去泛素化酶USP26基因的2个无义突变及6个错义突变对其酶活性的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：泛素特异性蛋白酶基因Usp26位于Xq26.2，其mRNA含2794个碱基对，可编码913个氨基酸，USP26蛋白预期分子量为104KDa。研究发现X染色体上存在许多可导致雄性不育的异常基因，其中就包括特异性表达于睾丸组织中的Usp26基因。2005年Stouffs等首次报道了Usp26基因突变与精子生成障碍的相关性，随后一些研究也先后提出Usp26基因突变会引起男性不育。但另外一些研究认为Usp26基因突变可能与精子生成障碍无关。然而，上述研究大部分为观察性研究，且USP26蛋白的功能也不十分清楚。本研究的目的是从分子水平研究分析野生型和突变型USP26蛋白的酶活性功能，以便了解Usp26基因突变的生物学意义。目前，有文献报道的Usp26基因突变有23个，其中有15个突变位点本课题组已成功构建并检测了其对泛素特异性蛋白酶USP26活性的影响发现这些位点突变并未影响USP26的去泛素化酶活性，认为Usp26基因中这15个突变位点可能与男性不育症并不相关。为了确证剩余8个突变位点（520GT、565GT、1037TA、1498GA、1549CT、1609CG、2182AT和2195TC）是否影响USP26的活性，本研究构建了这8个突变位点的表达质粒，采用已建立的去泛素化酶活性检测体系检测了各突变位点对USP26酶活性的影响，为进一步了解Usp26基因突变在男性不育中的作用奠定分子基础。 方法： 1构建pGEX-Usp26各种突变质粒。以本室保存的pGEX-Usp26WT为模板，采用定点突变的方法构建2个无义突变（520GT、565GT）及6个错义突变（1037TA、1498GA、1549CT、1609CG、2182AT和2195TC）的重组质粒，并用限制性内切酶酶切法和DNA测序法鉴定突变型重组质粒。 2构建pAC-T7-Usp26各突变质粒。采用限制性内切酶BamH I从已构建的pGEX-Usp26各突变质粒中切出Usp26基因目的片段，将其克隆到pAC-T7载体质粒，以构建pAC-T7-Usp26各突变质粒，并用Sal I和Pst I酶切鉴定。 3采用Ub-Met-β-gal和GST-Ub52两种不同的模型底物对各突变型USP进行去泛素化酶活性分析，，底物蛋白检测采用Western Blot法，利用Odyssey双色红外激光成像系统扫描观察结果。 结果： 1pGEX-Usp26突变质粒的构建：测序证实，质粒中所插入的2742bp片段为人类基因Usp26的编码区，其相应位点突变得到了证实这些突变导致的氨基酸变化分别是：E174X（X:终止密码子）（520GT）、E189X（565GT）、L346H（1037TA）、E500K（1498GA）、P517S（1549CT）、Q537E（1609CG）I728F（2182AT）以及F732S（2195TC）。2采用限制性内切酶Sal I和Pst I酶切鉴定构建的pAC-T7-Usp26各突变质粒，均可产生大小分别为1.5Kb和5.7Kb的两个片段，故成功构建了pAC-T7-Usp26各突变质粒。 3错义突变（1037TA、1498GA、1549CT、1609CG、2182AT和2195TC）对酶活性的影响：这6种突变型与USP26野生型一样，均能使模型底物Ub-Met-β-gal和GST-Ub52去泛素化，即各位点突变均不影响USP26的去泛素化酶活性。 4无义突变520GT和565GT仍均能使模型底物Ub-Met-β-gal和GST-Ub52去泛素化，未影响USP26的去泛素化酶活性。理论上2个无义突变分别只能编码Usp26的520个碱基和565个碱基（均不包括去泛素化酶活性中心），产生的蛋白应不再具有去泛素化酶活性。实际结果与理论相反的可能原因是在大肠埃希菌等某些原核生物中即便编码过程中有终止密码子，若其后仍有起始密码子-ATG-，则仍可跨越终止密码子继续向下编码。 5构建无义突变520*GT（522bp）、565*GT（567bp），发现两个突变型均不能去泛素化模型底物Ub-Met-β-gal及GST-Ub52，进一步验证了520GT、565GT位点突变若引起转录终止，则均可导致USP26去泛素化酶活性消失。 结论： 1成功构建了Usp26的2个无义突变（520GT、565GT）及6个错义突变（1037TA、1498GA、1549CT、1609CG、2182AT和2195TC）的重组质粒。 2去泛素化酶USP26的6个错义突变：1037TA、1498GA、1549CT、1609CG、2182AT和2195TC均未影响USP26的去泛素化酶活性。 3由于受限于原核生物表达系统，无义突变520GT和565GT同样未影响USP26的活性。
【关键词】：泛素特异性蛋白酶（USP26） 定点突变 基因表达 去泛素酶活性 男性不育
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R3416
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-10
• 前言10-11
• 材料与方法11-18
• 结果18-22
• 附图22-32
• 附表32-34
• 讨论34-35
• 结论35
• 参考文献35-39
• 综述 常见基因多态性与精子生成异常39-49
• 参考文献43-49
• 致谢49-50
• 个人简历50

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 张洁;邵小光;史艳彬;鄢磊;王磊;田宏;邱曙东;;泛素特异蛋白酶26基因多态性与特发性男性不育症的相关性研究[J];中华男科学杂志;2012年02期

2 史轶超;魏莉;崔英霞;黄宇烽;;性染色体与男性不育[J];中华男科学杂志;2010年05期

3 魏莉;史轶超;崔英霞;黄宇烽;;USP26基因突变与精子发生研究进展[J];中华男科学杂志;2010年01期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 张玮;泛素特异性蛋白酶Usp46和Usp26基因错义突变对去泛素化酶活性的影响及其流行病学意义[D];河北医科大学;2013年

中国硕士学位论文全文数据库 前3条

1 岳立达;泛素特异性蛋白酶USP26分子克隆及活性检测[D];河北医科大学;2013年

2 刘甜;泛素特异性蛋白酶USP26突变型去泛素化酶活性检测[D];河北医科大学;2013年

3 王超楠;泛素特异性蛋白酶USP46的错义突变A81V和T187P与ADHD的关联性研究[D];河北医科大学;2012年

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本文编号：310435