anisomycin诱导Jurkat T细胞凋亡相关基因的差异表达及其鉴定

发布时间：2017-04-16 14:17

  本文关键词：anisomycin诱导Jurkat T细胞凋亡相关基因的差异表达及其鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景：anisomycin作为一种蛋白合成抑制剂可以诱导多种细胞发生凋亡，此前本课题组已发现anisomycin能抑制人类急性T淋巴细胞性白血病(Jurkat T)细胞增殖、阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡，JNK信号通路的活化与anisomycin诱导Jurkat T细胞凋亡有关，miRNA let-7c可能参与JNK信号通路的活化介导JurkatT细胞凋亡，显示其应用于T淋巴细胞性白血病临床治疗的潜在可能性。因此，探明anisomycin诱导Jurkat T细胞凋亡的机制具有重要的科学意义。目前已发现哺乳动物细胞存在诸多与细胞凋亡相关的基因，在anisomycin诱导Jurkat T细胞凋亡过程中究竟有哪些细胞凋亡相关基因参与？它们是否与JNK/miRNAlet-7c关联？本研究利用qPCR基因芯片技术首次比较系统地分析了anisomycin诱导Jurkat T细胞凋亡相关基因的的差异性表达谱，以期进一步阐明anisomycin诱导Jurkat T细胞凋亡的机制，为其临床应用奠定一定基础。 目的：通过qPCR基因芯片技术筛选anisomycin诱导Jurkat T细胞凋亡相关基因的差异表达谱，确证差异表达基因E2F2是否与anisomycin诱导Jurkat T细胞凋亡有关，E2F2分子与介导anisomycin诱导Jurkat T细胞凋亡的miRNA let-7c之间是否存在关联。 方法：镜下观察不同浓度anisomycin处理组Jurkat T细胞形成集落的大小和数量；荧光显微镜下观察不同浓度anisomycin处理后Jurkat T细胞核染色质形态的变化；流式细胞术分析不同浓度anisomycin作用下Jurkat T细胞的凋亡率；qPCR基因芯片从88种细胞凋亡相关基因中筛选anisomycin作用后差异表达显著的13个基因；RT-PCR和qPCR在mRNA水平验证筛选出显著差异表达的基因，从中选出感兴趣的E2F2以确定其作用。转染miRNA let-7c模拟物和miRNAlet-7c抑制剂至Jurkat T细胞中，流式细胞术检测细胞凋亡率，qPCR和WesternBlot分别在基因和蛋白水平检测miRNA let-7c和E2F2的含量变化以证实miRNAlet-7c和E2F2与Jurkat T细胞凋亡是否有关；转染E2F2siRNA至Jurkat T细胞中，流式细胞术检测细胞凋亡率，qPCR和Western Blot分别在基因水平和蛋白水平检测let-7c和E2F2的含量变化以进一步确证E2F2与miRNA let-7c介导anisomycin诱导Jurkat T细胞凋亡是否关联。* 结果：随着anisomycin浓度的升高，Jurkat T细胞集落变小和数量减少；JurkatT细胞核皱缩，凋亡小体形成，凋亡细胞百分比与anisomycin的浓度成依赖性递增。qPCR基因芯片分析显示，anisomycin处理Jurkat T细胞1h后，AIFM2、CAS5、CD226、CD27、CIDEA、DAPK2、EGFR、ERBB3、FADD、FASLG、IFNA2、IFNB1、IGF1、IGF1R、IKBKG、IL10、IL1A、IL1B、IL6R、IL7、MAP3K1、MAP3K10、 MAP3K14、 NTRK1、 PDCD1、 PPP3CC、 STAT1、 STAT5B和TNFRSF10A共29个基因表达上调，AKT2、AKT3、CAS4、CD24、E2F2、EndoG、IKBKB、IL4、MAP3K5、PIK3R2、TNF和TNFRSF10B共12个基因表达下调，，其中，CD226、FADD和IL1B上调高达20~45倍，AKT2、CD24、E2F2、EndoG、IL4和PIK3R2基因下调10~20倍。anisomycin处理Jurkat T细胞6h后，APAF1、API5、CAS7、CAS9、CD226、CD27、E2F2、ERBB3、IFNB1、IGF1R、IL2、RIPK1、STAT1、TNFRSF10A和XIAP15个基因表达上调，DAPK3、FASLG、IKBKG、IL6R和IRAK15个基因表达下调，其中，CAS7、CAS9、CD226、IL2和TNFRSF10A5个基因上调达10~20倍，而FASLG和IL6R下调均达15倍左右。筛选出差异倍数10倍以上的13个基因，即CD226、CD24、E2F2、FASLG、TNFRSF10A、CAS7、CAS9、PIK3R2、IKBKB、AKT2、AKT3、FADD和EndoG，qPCR显示E2F2、PIK3R2、IKBKB、CD24、CAS9、CD226和TNFRSF10A7基因的qPCR结果与芯片的结果一致。miRNA let-7c可以促进Jurkat T细胞的凋亡，qPCR和Western Blot显示miRNAlet-7c增加E2F2的水平；敲低E2F2基因可以抑制细胞凋亡，并一定程度促进let-7c的基因表达。 结论：anisomycin能诱导Jurkat T细胞明显凋亡，可能与E2F2、PIK3R2、CD24、IKBKB、CAS9、CD226和TNFRSF10A有关；E2F2在anisomycin诱导Jukat T细胞凋亡过程中与miRNA let-7c相关联。这些结果有助于进一步阐明anisomycin诱导Jurkat T细胞凋亡的机制。
【关键词】：anisomycin 基因芯片 筛选 E2F2 miRNA let-7c 凋亡 Jurkat T
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-11
• 前言11-29
• 1 肿瘤的发生机制11-13
• 1.1 细胞周期检验点与肿瘤发生的关系11-12
• 1.2 细胞凋亡与肿瘤发生的关系12-13
• 1.3 自噬与肿瘤发生的关系13
• 2 细胞凋亡机制13-17
• 2.1 细胞表面凋亡受体 Fas 介导的细胞凋亡14-15
• 2.2 线粒体途径介导的细胞凋亡15-16
• 2.3 细胞凋亡相关因子16-17
• 3 anisomycin 的抗肿瘤作用17-18
• 4 qPCR 基因芯片技术18-19
• 5 细胞凋亡相关基因19-27
• 5.1 CD22619-20
• 5.2 CD2420
• 5.3 E2F220-21
• 5.4 TNFRSF10A21-22
• 5.5 Endonuclease G22
• 5.6 AKT 家族22-23
• 5.7 Caspase 家族23-24
• 5.8 FADD24-25
• 5.9 FASLG25-26
• 5.10 IKBKB26
• 5.11 PIK3R226-27
• 6 研究思路与目的27-29
• 材料与方法29-50
• 1 细胞株29
• 2 试剂29-31
• 3 主要仪器31-32
• 4 主要溶液的配制32-35
• 5 细胞培养35
• 6 集落的观察35
• 7 Hoechst 染色35-36
• 8 Annexin V / PI 双染色36
• 9 PCR Array36-42
• 9.1 提取细胞总 RNA36-37
• 9.2 RNA 样品的完整性、浓度和纯度的检测37
• 9.3 逆转录37-38
• 9.4 PCR Array 实时定量 PCR 检测38-39
• 9.5 RT-PCR39-42
• 9.5.1 细胞总 RNA 的提取39
• 9.5.2 RT39-40
• 9.5.3 PCR40-42
• 9.6 实时定量 PCR42
• 10 Western Blot42-44
• 10.1 细胞胞浆蛋白的提取42-43
• 10.2 电泳43
• 10.3 转膜43
• 10.4 封闭、抗体结合与显色43-44
• 11 miRNA let-7c 的应用44-47
• 11.1 细胞处理及转染44-45
• 11.2 Annexin V/PI 双染色45
• 11.3 qPCR45
• 11.4 Western Blot45-46
• 11.5 ELISA46-47
• 12 E2F2 siRNA 的应用47-49
• 12.1 细胞处理及转染47
• 12.2 Annexin V/PI 双染色47-48
• 12.3 qPCR48
• 12.4 Western Blot48-49
• 12.4.1 细胞内核蛋白的提取48-49
• 12.5 ELISA49
• 13 统计学分析49-50
• 结果50-72
• 1 anisomycin 抑制 Jurat T 细胞集落形成的影响50
• 2 anisomycin 对 Jurkat T 细胞核边集的影响50-51
• 3 anisomycin 诱导 Jurkat T 细胞凋亡51-52
• 4 anisomycin 诱导 Jurkat T 细胞凋亡相关基因差异表达的筛选52-57
• 5 anisomycin 诱导 Jurkat T 细胞凋亡基因差异表达的鉴定57-62
• 6 miRNA let-7c 在 anisomycin 诱导 Jurkat T 细胞凋亡中的作用62
• 7 miRNA let-7c 对 Jurkat T 细胞内 E2F2 的影响62-66
• 7.1 miRNA let-7c 对 Jurkat T 细胞 E2F2 mRNA 水平的影响62-65
• 7.2 miRNA let-7c 对 Jurkat T 细胞 E2F2 蛋白水平的影响65-66
• 8 miRNA let-7c 对 Jurkat T 细胞分泌细胞因子的影响66-67
• 9 E2F2 siRNA 在 anisomycin 诱导 Jurkat T 细胞凋亡中的作用67-69
• 9.1 E2F2 siRNA 对 Jurkat T 细胞 E2F2 蛋白水平的影响67
• 9.2 E2F2 siRNA 对 Jurkat T 细胞凋亡的影响67-69
• 10 E2F2 siRNA 对 Jurkat T 细胞内 miRNA let-7c 的影响69-71
• 10.1 Jurkat T 细胞中 miRNA let-7c 在基因水平的半定量变化69
• 10.2 E2F2 siRNA 对 Jurkat T 细胞 miRNA let-7c mRNA 的定量影响69-71
• 11 anisomycin 对 Jurkat T 细胞分泌细胞因子的影响71-72
• 讨论72-78
• 1 凋亡相关基因差异表达谱的分析72-74
• 2 miRNA let-7c 在 anisomycin 诱导 Jurkat T 细胞凋亡中的作用74-75
• 3 E2F2 在 anisomycin 诱导 Jurkat T 细胞凋亡中的作用75-76
• 4 miRNA let-7c 与 E2F2 之间存在的可能关系76-78
• 小结78-79
• 参考文献79-86
• 发表论文86-87
• 致谢87-88
• 英文缩略词表88

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 Daniele Baiz;Barbara Dapas;Rossella Farra;Bruna Scaggiante;Gabriele Pozzato;Fabrizio Zanconati;Nicola Fiotti;Lara Consoloni;Sara Chiaretti;Gabriele Grassi;;Bortezomib effect on E2F and cyclin family members in human hepatocellular carcinoma cell lines[J];World Journal of Gastroenterology;2014年03期

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本文编号：311000