呼吸道合胞病毒的逆转录环介导等温扩增检测及流行病学分析

发布时间：2017-04-17 03:07

  本文关键词：呼吸道合胞病毒的逆转录环介导等温扩增检测及流行病学分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：人呼吸道合胞病毒(RSV)是一种非分节负链RNA病毒,基因组全长15.2Kb左右,依据基因序列及抗原反应性差异将所有RSV分为A和B两族,每个族还可以分为多个基因型。RSV具有很强的感染性,且感染的致死率较高。现在已经发展了多种RSV检测方法,然而这些方法都存在一定的缺陷。关于上海地区RSV的流行病学至今没有很好的调查。 为了探索新的RSV检测方法,我们利用逆转录环介导等温扩增(Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP)对RSV进行了检测。首先,利用生物信息学方法,对49株RSV全基因组序列进行了多重比对分析,并找出基因组中的保守区域,设计出了针对A族和B族RSV的共12条引物。然后应用正交设计的方法优化得到了最适于所设计引物的反应体系,并用该体系对引物的灵敏性和特异性进行了检测。针对灵敏性,利用该体系和所设计的引物测定了对A和B族的RSV的检测限,发现对A族毒株检测限为5X101.75TCID50/ml,对B族毒株的检测限为5×10-0.5TCID50/ml,均低于临床样本中的RSV滴度。进一步,使用本方法对77个呼吸道样本进行了检测,检出率47%,与目前常用的RT-PCR检测方法检出率相当。 为了对上海地区RSV的流行病学状况进行调查,我们收集了来自于南翔医院从2009到2012年间的2407个呼吸道鼻咽拭子样品,通过多重PCR检测到184个RSV阳性样本,根据RSV样本的时间分布发现上海地区在2009-2010流行季经历了一次RSV病毒大爆发。对184个样本进一步进行了DNA序列测定,获得了69条RSV内G蛋白C末端区域序列(该区域为RSV基因分型的通用区域),结合以前的报道,通过进化分析确定上海地区分布着分属A和B两族的10个RSV基因型。根据两族RSV的时间分布分析发现,上海地区的流行毒株经历了从B族(2009—2010流行季)到A族(随后两个流行季)的转变。根据基因型的时间分布发现,在RSV爆发的季节,有大量的基因型共流行,同时会有大量新基因型出现。在基因型分析中发现,在2010-2011流行季上海地区发现了两个月前在加拿大刚刚出现的ON1基因型,这暗示RSV可能在一个流行季中在不同大洲间传播。
【关键词】：呼吸道合胞病毒 环介导的等温扩增 流行病学 基因型 病原诊断
【学位授予单位】：上海师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R373.14
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 第一章 绪论9-27
• 1.1 呼吸道合胞病毒的发现9
• 1.2 病毒的理化性质9-11
• 1.3 病毒的蛋白及基因组成11-15
• 1.4 病毒的感染和复制15-16
• 1.5 病毒间差异16-18
• 1.6 流行病学概况18-19
• 1.7 保护性免疫反应19-21
• 1.8 病理特性21-22
• 1.9 动物模型22-23
• 1.10 抗病毒药物及疫苗23-25
• 1.11 选题意义25-27
• 第二章 RSV的RT-LAMP检测试剂盒的开发27-42
• 2.1 材料方法28-32
• 2.1.1 病毒株及临床样本28-29
• 2.1.2 RT-LAMP的引物设计29
• 2.1.4 RT-LAMP反应条件优化29-30
• 2.1.5 RT-LAMP反应30-31
• 2.1.6 RT-PCR反应31-32
• 2.2 结果32-39
• 2.2.1 RSV的RT-LAMP引物的设计32-35
• 2.2.2 反应体系的优化35-37
• 2.2.3 引物反应性能分析37-38
• 2.2.4 该RT-LAMP检测的检测限的确定38-39
• 2.2.5 该RT-LAMP方法对临床样本的检测能力39
• 2.3 小结39-42
• 第三章 上海地区RSV的流行病学分析42-58
• 3.1 材料方法43-46
• 3.1.1 样本收集43
• 3.1.2 RNA提取及RSV感染鉴定43-44
• 3.1.3 RSV特异PCR扩增及G基因第二高变区测序44-45
• 3.1.4 进化分析45-46
• 3.2 结果46-57
• 3.2.1 样本收集46-47
• 3.2.2 RSV感染的季节分布47-49
• 3.2.3 基因型在流行季节间的改变49
• 3.2.4 上海地区A族RSV的特点49-52
• 3.2.5 上海地区B族RSV的特点52-56
• 3.2.6 基因型在流行季节间的分布规律56
• 3.2.7 RSV毒株全球传播趋势56
• 3.2.8 短序列改变所受的选择作用56-57
• 3.3 小结57-58
• 第四章 结论58-60
• 致谢60-61
• 参考文献61-73
• 主要科研成果73-76
• 1, 论文73
• 2, 专利73-76
• 附件76

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