人巨细胞病毒US31蛋白特异性抗体的制备及鉴定

发布时间：2021-04-08 06:05

　　目的:探讨人巨细胞病毒（HCMV）US31蛋白及其多克隆抗体的制备及鉴定方法。方法:HCMV US31基因经原核密码子优化后进行全基因合成,克隆至pET21a（+）原核表达载体,构建pET21a（+）/HCMV US31重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导目的蛋白表达,Ni-NTA亲和层析法纯化US31蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA、Western blot及免疫荧光方法检测抗体效价和特异性。结果:在大肠杆菌中诱导出高表达的HCMV US31融合蛋白,经Ni-NTA亲和纯化后获得高纯度的目的蛋白;免疫新西兰兔诱导产生特异性的IgG抗体,效价为1:49 600;经ELISA、Western blot以及免疫荧光均证实制备的特异性抗体可识别细胞中表达的US31蛋白。结论:成功制备了HCMV US31蛋白及特异性抗体,为进一步研究US31蛋白的生物学功能奠定了基础。 

【文章来源】：温州医科大学学报. 2019,49(08)

【文章页数】：5 页

【部分图文】：

HCMVUS31原核表达重组质粒的构建和鉴定250bp100bp

岩?；4：10 mmol/L咪唑洗脱液；5：50 mmol/L咪唑洗脱液；6：100 mmol/L咪唑洗脱液；7：200 mmol/L咪唑洗脱液；8：500 mmol/L咪唑洗脱液；9：过柱平衡液洗脱液2图2 pUS31蛋白原核表达和纯化鉴定图A：不同免疫时间点US31蛋白血清抗体反应检测，血清稀释比为1:100；B：免疫6周兔血清US31蛋白特异性抗体效价检测图3 HCMV US31特异性抗体效价分析A：Western blot检测US31蛋白表达，一抗采用本次研究制备的US31兔多克隆抗体（1:5 000），二抗采用联科生物的羊抗兔抗体（1:1 000）；B：免疫荧光检测HCMV US31的表达（× 200）图4 US31特异性抗体检测HEK293T细胞中目的蛋白的表达第0周OD450OD450第2周第4周稀释度时间第6周1:401:1601:6401:25601:102401:409601:1638402.02.0pUS31组PBS组pUS31组PBS组1.51.51.01.00.50.500US31DAPIMergeAd-US31ControlUS31ABAd-US31ControlGAPDHtrol组转染的293T细胞作用时，Control组病毒转染的细胞未见红色荧光，Ad-US31组转染的HEK293T细胞可见红色荧光，且大部分位于细胞核周，见图4B。3讨论当机体免疫力低下时，潜伏感染的HCMV被激活，常导致移植失败、HCMV肺炎、肝炎甚至死亡等

【参考文献】：
期刊论文
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硕士论文
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本文编号：3125002