探索FtsZ突变体影响E.coli中MreB细胞定位模式的分子机制

发布时间：2017-04-17 06:00

  本文关键词：探索FtsZ突变体影响E.coli中MreB细胞定位模式的分子机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景 细菌耐药性问题日益严重，越来越多的细菌对现有抗菌药物产生了耐药性。天然抗生素是细菌产生的一种次生代谢产物，被用于对抗其他微生物以保护自身安全的化学物质。而微生物接触到这种物质时对抗菌药物的抵抗主要是通过改变自身代谢途径或产生相应的灭活物质，，这给临床抗感染治疗带来极大的挑战。开发新靶点的抗生素迫在眉睫，FtsZ（Filamentous temperature sensitive）是介导细菌细胞分裂的关键的微管蛋白同系物且与人类微管蛋白序列具有较大的差异性，从而能够设计出选择性作用于细菌FtsZ而不干扰宿主细胞的抑制剂，FtsZ蛋白有希望成为研究抗菌药物的新靶点。 大肠杆菌有两个基本的细胞骨架蛋白质，FtsZ和MreB。FtsZ是高度保守的GTP酶，同源于真核细胞的微管蛋白。它能够在细胞的中间位置形成一个环状结构，主要功能是在质体分裂过程中起到支架的作用，并且形成一个多样的蛋白质复合体负责细胞的分裂。在细菌中，FtsZ被认为是定位在将要分裂部位的第一种蛋白质，在大肠杆菌E.coli中一个环状结构包含FtsZ（Z环）以及被吸附的其他分裂蛋白所组成，它们在细菌细胞中点位置形成一个分裂体。这对于隔膜综合体的形成以及细胞分裂是必不可少的。 细菌细胞分裂是由微管蛋白类似物FtsZ所控制而细胞的伸长是由肌动蛋白类似物MreB控制。MreB是一种类似肌动蛋白的ATP酶，同时也是维持大肠杆菌细胞典型的杆状和细胞极性的一种最基本的酶。MreB的功能还涉及染色体的分裂，细胞器在细胞膜上的定位以及合成协调细胞分裂的生物物质。因为FtsZ和MreB涉及到细胞一系列基本的功能，所以当它们的功能受到抑制时会导致细胞死亡。 一个动态的蛋白质网络主要包括蛋白质募集和转运以及细胞的运动和分裂。细胞中内部程序的协调运作与肌动蛋白和微管蛋白同系物的作用密不可分。在原核生物中，微管蛋白对肌动蛋白的作用主要是调控肌动蛋白并与之相互协调。FtsZ和MreB能够形成大分子结构分别对于细胞分裂和细胞形状的维持具有重要的意义。但是如何协调细菌的生长和分裂目前的研究还尚不清楚。所以深入研究细胞骨架的功能，了解肌动蛋白和微管蛋白家族之间的协调作用是非常重要的。 有报道指出，FtsZ和MreB之间直接的相互作用能够促进细菌细胞分裂和细胞增长。我们利用活细胞成像技术，观察到大肠杆菌的MreB和FtsZ在细胞内的定位模式及共定位现象，通过对FtsZ的氨基酸序列和三维结构进行分析，我们选择几个重要的氨基酸位点作为突变靶点进行点突变，发现FtsZ的突变体影响了MreB在E.coli中的定位。对Pull-Down和western blot结果分析进一步发现，MreB和FtsZ的相互作用是MreB在细胞内螺旋定位的重要条件。本研究结果有力的证明了负责细胞分裂的蛋白与负责细胞形态的蛋白在功能上相互协调的重要性，为深入探讨细菌是如何协调分裂与生长及正常形态维持的分子机制提供了实验支持。 目的 1.研究FtsZ和MreB在细胞内的定位模式； 2.FtsZ部分突变体对MreB在细胞内螺旋定位的影响； 3.FtsZ影响MreB细胞内定位的分子机制。 方法 1.利用同源重组技术从大肠杆菌基因组中敲除MreB基因； 2.构建不同的质粒表达FtsZ-YFP、YFP-FtsZ、YFP-MreB的融合蛋白，利用荧光显微镜研究FtsZ和MreB在细胞内的定位模式； 3.利用重叠PCR构建不同的FtsZ突变体，探索大肠杆菌中FtsZ的突变体是否影响MreB的定位以及分子机制。结果 1. FtsZ在E. coli中形成环状结构； 2.MreB在E.coli中形成螺旋状结构； 3.FtsZ与MreB在细胞内相互作用，且在一定的时相共定位于E.coli相应的部位； 4.FtsZ突变体影响MreB荧光定位模式的分子机制主要是影响了FtsZ-MreB间的相互作用。 结论 FtsZ与MreB的相互作用是MreB在细胞内螺旋定位的重要条件。
【关键词】：FtsZ MreB Z环
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 英文缩略词表（ABBREVIATION）11-12
• 前言12-14
• 1 材料、实验试剂与仪器14-22
• 1.1 材料14-15
• 1.2 实验试剂15
• 1.3 实验仪器与设备15-16
• 1.4 主要溶液的配制16-22
• 2 方法22-36
• 2.1 载体的构建22-26
• 2.1.1 引物设计22-23
• 2.1.2 E.coli 基因组 DNA 的制备23
• 2.1.3 PCR 扩增 FtsZ 基因23-24
• 2.1.4 DNA 片段胶回收24-25
• 2.1.5 酶切25
• 2.1.6 连接(载体与目的片段的摩尔比为 1:3)25-26
• 2.2 质粒的提取26-30
• 2.2.1 制备超级感受态细胞26
• 2.2.2 CaCl2法制备感受态细胞26-27
• 2.2.3 电转化感受态细胞的制备27-28
• 2.2.4 质粒的化学转化28
• 2.2.5 质粒的电转化28-29
• 2.2.6 质粒的提取29-30
• 2.5 目标蛋白的诱导表达30
• 2.6 细菌的冻存30
• 2.7 细菌裂解及菌体蛋白的制备30-31
• 2.8 蛋白质凝胶电泳31
• 2.9 蛋白免疫印迹分析31-33
• 2.10 荧光显微镜和激光共聚焦显微镜33
• 2.11 PULL DOWN 分析33-36
• 3 结果36-54
• 3.1 不同细菌来源的 FTSZ 同源性分析36-38
• 3.2 E.COLI 的 FTSZ 蛋白结构预测38-39
• 3.3 PFL13 表达载体构建39-44
• 3.4 LF6(△MREB)菌株的构建44-48
• 3.5 MREB 在 E.COLI 中形成螺旋状结构48-49
• 3.6 MREB 在 LF6(△MREB)中的定位模式49
• 3.7 FTSZ 在 E.COLI 中形成环状结构49-50
• 3.8 FTSZ 的突变体是否影响 MREB 的定位50-52
• 3.9 FTSZ 是否影响 E. COLI 中 MREB 的荧光定位模式52
• 3.10 FTSZ 与 MREB 在细胞内相互作用，且在一定的时相共定位于 E.COLI 相应的部位52-53
• 3.11 FTSZ 突变体影响 MREB 荧光定位模式的分子机制主要是影响了 FTSZ-MREB 间的相互作用53-54
• 4 讨论54-56
• 结论56-58
• 参考文献58-60
• 综述60-68
• 参考文献65-68
• 致谢68-70

【共引文献】

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 曾宪玉;丙酸杆菌的耐药研究及盐酸小檗碱对耐药株的抑制机制研究[D];湖南中医药大学;2014年

中国硕士学位论文全文数据库 前2条

1 段晨帆;乙醇对大鼠原代大脑皮质星形胶质细胞GFAP及Plk2表达的影响[D];大连医科大学;2012年

2 王元泽;作用于FtsZ蛋白PC位点的新型3-MBA衍生物的合成及抗菌活性研究[D];山东大学;2014年

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本文编号：312544