金葡菌毒力调节因子RAP及TRAP的基础研究

发布时间：2021-04-09 20:47

　　RNAⅢ分子是调控金黄色葡萄球菌毒力因子表达的关键分子。最新的研究认为，金葡菌分泌的RAP（RNAⅢ activating protein）能磷酸化其靶蛋白TRAP，从而激活RNAⅢ的转录。但是目前对RAP尚存在争议，因而RAP-TRAP通路仍需详尽的研究。参照文献报道的方法，我们实验室从金葡菌的培养上清中初步纯化到了能够激活RNAⅢ转录的成分（RAP样蛋白），以这些粗纯成分为靶，从噬菌体随机展示肽库中筛选到了具有抑制RNAⅢ转录活性的结合肽序列R15。另外生物质谱鉴定了其中的蛋白条带。本课题的目的是在以上工作的基础上对RAP-TRAP毒力调节通路进行深入的研究。本研究首先利用大肠杆菌分别表达了生物质谱鉴定出的Beta-溶血素和PV白细胞毒素S蛋白（均去除了信号肽部分）。Northern Blot证实表达的这两种蛋白均不具有RNAⅢ激活活性。截留金葡菌培养上清，证实确实存在大于10kD的RNAⅢ激活成分。可能是RAP特殊的理化特性而使得对它的鉴定成为研究的瓶颈。接着，我们对作用肯定的TRAP蛋白进行了深入探讨，包括TRAP蛋白的细胞定位和TRAP细胞外结合蛋白的钓取、鉴定。与生物信息学... 

【文章来源】：中国人民解放军军事科学院北京市

【文章页数】：113 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

重组载体构建策略图

分别以提取的04018基因组DNA和RN639OB基因组DNA为模板，以介成的beta一溶血素基因_一匕下游引物，利用高保真的pfu聚和酶进行PcR:，将PcR产物进行电泳，电泳图谱显示PcR产物均为单一条带，分子量为90obp左右(图1.2)，与预期相同。图1.2以金葡菌基因组为模板PCR扩增beta一溶血素基因电泳图1:04018基因组为模板的PCR产物2:RN6390B基因组模板的PCR产物1.3.2.3重组质粒的鉴定回收PCR产物，37℃双酶切过夜，回收酶切后的产物，T4DNA连接酶连接目的基因片段与经过同样双酶切并回收的pET-28a(+)载体部分，转化感受态细菌DH5a，挑取转化后的3个单个克隆活化，利用引物对菌液直接进行PCR鉴定(图1.3)。提取PCR鉴定阳性菌的质粒进行酶切鉴定(图1.4)，可见重组质粒的BamHI位点被插入的基因片段缺失掉而使不能线性化

PCR鉴定克隆电泳图


本文编号：3128289