HER2/neu-IL12融合基因疫苗的构建及其对小鼠乳腺癌的预防和治疗作用
发布时间：2021-04-15 18:39
目的:（1）构建人表皮生长因子受体（HER2/neu）胞外区基因的真核表达质粒（pcDNA6-HER2/neu）;转染小鼠乳腺癌细胞（EMT6）,获得其稳定表达细胞株（EMT6/HER2/neu）。（2）构建HER2neu、IL12融合基因重组核酸疫苗pcDNA6-HER2/neu-IL12。（3）将该疫苗在HER2/neu阳性乳腺癌小鼠体内应用,探讨其预防和治疗作用。方法:（1）HER2/neu重组质粒的构建:用PCR从含HER2/neu全长基因的pcDNA3.1-HER2/neu质粒上扩增HER2/neu胞外区（ECD）基因片段;经酶切、连接构建pcDNA6-HER2/neu,通过酶切及测序鉴定;（2）建立HER2/neu阳性小鼠乳腺癌细胞株（EMT6/HER2/neu）:以PEI法将pcDNA6-HER2/neu导入小鼠乳腺癌细胞（EMT6）中,经杀稻瘟菌素（Blasticidin）筛选,获得抗性克隆EMT6/HER2/neu;用RT-PCR检测EMT6/HER2/neu中HER2/neu mRNA,免疫组化法检测其HER2/neu蛋白的表达。（3）pcDNA6-HER2/neu...
【文章来源】：青岛大学山东省
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
菌液PCR鉴定HERZ/neu结果
再以含维持量的 Blasticidin(终浓度为Zm留L)培养液进行克隆扩增，得到EMT6/HER2/neu(实验组)和EMT6/PcDNA6(对照组)两种细胞株。而未经转染的正常EMT6细胞在上述筛选压力下4天内死亡脱落。如图2.4。图2.4转染PcDNA6一HEFZ/neu细胞与正常EMT6细胞加筛选压力后的生长状态A:EMT6压 [ERZ/neu单克隆;B:正常EMT6 2.2.1RT·PCR测定 HERZ/neumRNA的表达按 TRIzolRNA提取试剂盒提取细胞mRNA，经Rl’ -PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳显示，EMT6沮ERZ/neu细胞的mRNA最终扩增出大小约为1896bp的片段，而未转染的EMTh细胞及转染空质粒的EMT6/PcDNA6细胞均未见此条带，如图2.5。l4
图2.3pcDNA6-HEFZ/neu双酶切鉴定结果RZ加eu对照;2一8:HERZ/neuPCR阵汁险克隆;9:DLKaRa公司测序，结果显示PcDNA6一HERZ/ne确。ERZ/neu转染EMT6细胞及阳性克隆Blastic记in(终浓度为10m留L)持续筛选10天后Blasticidin(终浓度为Zm留L)培养液进行克隆扩和EMT6/PcDNA6(对照组)两种细胞株。而压力下4天内死亡脱落。如图2.4。
【参考文献】：
期刊论文
[1]重组HER2真核表达载体的构建及其稳定转染EMT6细胞株的筛选[J]. 徐腾飞,张文卿,于红,李丹. 细胞与分子免疫学杂志. 2009(03)
[2]重组腺病毒载体mIL-12治疗小鼠黑色素瘤的实验研究[J]. 张建华,赵德矿,王青青,沈芬平,翁跃颂. 细胞与分子免疫学杂志. 2007(06)
[3]混合性热休克蛋白/肽疫苗与白细胞介素-12联合诱导特异性细胞毒T淋巴细胞产生的实验研究[J]. 宋舸,袁玫,崔雪梅,眭翔,赵斌,卢世璧. 中国康复理论与实践. 2007(03)
[4]人IL-12重组质粒对S-180荷瘤小鼠的治疗作用[J]. 孙运芳,张文卿,王丽娜,于红,李丹. 中华肿瘤防治杂志. 2007(05)
[5]用细胞因子流式细胞计数术体外检测重组人IL-12的生物学活性[J]. 张文卿,王丽娜,刘志军,Dernard Mariameb,于红,杨忠思,于修平. 中华微生物学和免疫学杂志. 2006(04)
[6]HER-2/neu基因在肿瘤免疫治疗中的研究进展[J]. 孙文欣. 国外医学(免疫学分册). 2005(01)
[7]Combined gene therapy of endostatin and interleukin 12 with polyvinylpyrrolidone induces a potent antitumor effect on hepatoma[J]. Pei-Yuan Li Ju-Sheng Lin Zuo-Hua Feng Yu-Fei He He-Jun Zhou Xin Ma Xiao-Kun Cai De-An Tian Institute of Liver Diseases,Tongji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,Hubei Province,ChinaDepartment of Biochemistry and Molecular Biology,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,Hubei Province,China. World Journal of Gastroenterology. 2004(15)
[8]HER-2neu胞外区基因疫苗的免疫避孕作用[J]. 倪晶,倪翼,张瑞华,熊思东. 中国免疫学杂志. 2004(04)
[9]HER2/neu动物模型的建立和免疫学鉴定[J]. 方路,吴玉章. 第三军医大学学报. 2003(13)
[10]HER-2/neu胞外配体结合区基因的克隆及原核表达[J]. 徐明,郭宁,冯健男,施明,胡美茹,沈倍奋. 免疫学杂志. 2003(03)
本文编号：3139880
【文章来源】：青岛大学山东省
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
菌液PCR鉴定HERZ/neu结果
再以含维持量的 Blasticidin(终浓度为Zm留L)培养液进行克隆扩增，得到EMT6/HER2/neu(实验组)和EMT6/PcDNA6(对照组)两种细胞株。而未经转染的正常EMT6细胞在上述筛选压力下4天内死亡脱落。如图2.4。图2.4转染PcDNA6一HEFZ/neu细胞与正常EMT6细胞加筛选压力后的生长状态A:EMT6压 [ERZ/neu单克隆;B:正常EMT6 2.2.1RT·PCR测定 HERZ/neumRNA的表达按 TRIzolRNA提取试剂盒提取细胞mRNA，经Rl’ -PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳显示，EMT6沮ERZ/neu细胞的mRNA最终扩增出大小约为1896bp的片段，而未转染的EMTh细胞及转染空质粒的EMT6/PcDNA6细胞均未见此条带，如图2.5。l4
图2.3pcDNA6-HEFZ/neu双酶切鉴定结果RZ加eu对照;2一8:HERZ/neuPCR阵汁险克隆;9:DLKaRa公司测序，结果显示PcDNA6一HERZ/ne确。ERZ/neu转染EMT6细胞及阳性克隆Blastic记in(终浓度为10m留L)持续筛选10天后Blasticidin(终浓度为Zm留L)培养液进行克隆扩和EMT6/PcDNA6(对照组)两种细胞株。而压力下4天内死亡脱落。如图2.4。
【参考文献】：
期刊论文
[1]重组HER2真核表达载体的构建及其稳定转染EMT6细胞株的筛选[J]. 徐腾飞,张文卿,于红,李丹. 细胞与分子免疫学杂志. 2009(03)
[2]重组腺病毒载体mIL-12治疗小鼠黑色素瘤的实验研究[J]. 张建华,赵德矿,王青青,沈芬平,翁跃颂. 细胞与分子免疫学杂志. 2007(06)
[3]混合性热休克蛋白/肽疫苗与白细胞介素-12联合诱导特异性细胞毒T淋巴细胞产生的实验研究[J]. 宋舸,袁玫,崔雪梅,眭翔,赵斌,卢世璧. 中国康复理论与实践. 2007(03)
[4]人IL-12重组质粒对S-180荷瘤小鼠的治疗作用[J]. 孙运芳,张文卿,王丽娜,于红,李丹. 中华肿瘤防治杂志. 2007(05)
[5]用细胞因子流式细胞计数术体外检测重组人IL-12的生物学活性[J]. 张文卿,王丽娜,刘志军,Dernard Mariameb,于红,杨忠思,于修平. 中华微生物学和免疫学杂志. 2006(04)
[6]HER-2/neu基因在肿瘤免疫治疗中的研究进展[J]. 孙文欣. 国外医学(免疫学分册). 2005(01)
[7]Combined gene therapy of endostatin and interleukin 12 with polyvinylpyrrolidone induces a potent antitumor effect on hepatoma[J]. Pei-Yuan Li Ju-Sheng Lin Zuo-Hua Feng Yu-Fei He He-Jun Zhou Xin Ma Xiao-Kun Cai De-An Tian Institute of Liver Diseases,Tongji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,Hubei Province,ChinaDepartment of Biochemistry and Molecular Biology,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,Hubei Province,China. World Journal of Gastroenterology. 2004(15)
[8]HER-2neu胞外区基因疫苗的免疫避孕作用[J]. 倪晶,倪翼,张瑞华,熊思东. 中国免疫学杂志. 2004(04)
[9]HER2/neu动物模型的建立和免疫学鉴定[J]. 方路,吴玉章. 第三军医大学学报. 2003(13)
[10]HER-2/neu胞外配体结合区基因的克隆及原核表达[J]. 徐明,郭宁,冯健男,施明,胡美茹,沈倍奋. 免疫学杂志. 2003(03)
本文编号：3139880
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