日本血吸虫Vasa样蛋白基因的获得、表达及初步鉴定

发布时间：2017-04-17 19:28

  本文关键词：日本血吸虫Vasa样蛋白基因的获得、表达及初步鉴定，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：在获得日本血吸虫Vasa样蛋白基因的cDNA全长序列后,选取含有DEAD-BOX家族高度保守的一段基因序列进行体外诱导表达、蛋白纯化和虫体免疫定位,同时研究Vasa在日本血吸虫生活史的各个阶段mRNA和蛋白的表达情况,从而为进一步研究Vasa基因在日本血吸虫生殖生物学方面的功能和作用奠定基础。 方法：以日本血吸虫cDNA为模板,扩增获得日本血吸虫Vasa样基因全长序列。将其全长序列经BLAST软件分析,利用贝叶斯法建立了日本血吸虫Vasa基因的系统进化树。选择SjVasa全长序列中含有DEAD-BOX家族的碱基序列进行扩增并在体外诱导表达、纯化蛋白。用纯化后的蛋白免疫Balb/c、鼠,获得抗Vasa蛋白的多克隆抗体。用荧光定量PCR和Western-Blot的方法分别检测了日本血吸虫Vasa mRNA和蛋白在血吸虫生活史不同时期(虫卵、尾蚴、12天童虫、18天雌虫和雄虫、24天雌虫和雄虫和36天雌虫和雄虫)的表达量。用血吸虫成虫琼脂石蜡双包埋法切片,免疫组化实验方法观察SjVasa在日本血吸虫成虫的定位。 结果：PCR扩增获得了一个碱基数目为2820bp,共编码936个氨基酸,理论相对分子量37kD,等电点为8.75的血吸虫基因。选取DEAD-BOX基因的代表来构建系统进化树,从系统进化枝来看,该日本血吸虫基因与其他物种Vasa基因聚为一支,确定为日本血吸虫Vasa基因,属于DEAD-BOX家族,并且与曼氏血吸虫的Vasa样基因亚型(Smvlg3)同源性达到94%,将其命名为日本血吸虫Vasa并在GenBank注册。荧光定量PCR和Western-blot结果均显示SjVasa mRNA和蛋白的表达量在尾蚴期到24天产卵期这段时间一直持续增长,18天的SjVasa mRNA和蛋白表达量相对于12天童虫的表达量均具有统计学意义(P0.05),SjVasa mRNA转录和蛋白表达量在24天的雌虫最高,具有显著性差异(P0.05)。琼脂石蜡双包埋法切片免疫组化结果显示,Vasa蛋白主要分布于雌虫卵黄腺、卵巢末端较为成熟的卵细胞和代谢旺盛的体壁组织；在雄虫的睾丸细胞和代谢旺盛的体壁组织也有分布。 结论：本实验成功扩增出日本血吸虫Vasa样蛋白基因的全长并上传到Genebank上进行注册,注册号：(AFC17964)；成功表达和纯化原核表达蛋白并制备了该蛋白的多克隆抗体；通过荧光定量PCR技术分析显示,该基因在日本血吸虫的各期雌雄虫体均有表达,尾蚴期到24天产卵期这段时间一直持续增长,其中在24天的雌虫体内表达量最高,雌虫表达量略高于雄虫。用Western-blot方法在蛋白水平上进行了分析,结果和荧光定量PCR基本一致。免疫组化结果显示Vasa蛋白在雌虫主要分布于卵黄腺和代谢旺盛的体壁组织以及在卵巢末端的较为成熟的卵细胞；在雄虫睾丸部分细胞和代谢旺盛的体表组织也有分布。SjVasa蛋白在血吸虫雌雄虫体内均有表达且主要分布在生殖细胞以及代谢旺盛的细胞中,提示SjVasa蛋白可能在日本血吸虫细胞分化和增殖发育中具有一定的调控作用,其确切的功能有待进一步研究。
【关键词】：日本血吸虫 Vasa样基因 蛋白定位
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R383.2;R3416
【目录】：

• 中英文缩略词对照表6-7
• 中文摘要7-9
• ABSTRACT9-10
• 1 前言10-12
• 2 材料与方法12-33
• 2.1 材料12-17
• 2.1.1 主要软件12
• 2.1.2 菌株和质粒12
• 2.1.3 实验动物12
• 2.1.4 主要试剂12
• 2.1.5 部分试剂的配置方法12-17
• 2.2 实验方法17-33
• 2.2.1 日本血吸虫Vasa样蛋白全长基因扩增17-18
• 2.2.2 日本血吸虫Vasa基因的生物信息学分析18-19
• 2.2.3 pET28a(+)-SjVasa重组质粒的构建和鉴定19-21
• 2.2.4 pET28a(+)-SjVasa蛋白的表达及SDS-PAGE分析21-23
• 2.2.5 pET28a(+)-SjVasa蛋白的变性、纯化及复性23-25
• 2.2.6 抗SjVasa蛋白多克隆抗体制备25-26
• 2.2.7 SjVasa蛋白多克隆抗体的效价检测26
• 2.2.8 荧光定量PCR检测SjVasa基因在不同时期血吸虫的表达26-29
• 2.2.9. Western-blot检测SjVasa蛋白在虫卵及各期虫体的表达29-31
• 2.2.10 免疫组化检测SjVasa蛋白在虫体的定位31-33
• 3 结果33-41
• 3.1 SjVasa基因全长的扩增33
• 3.2 SjVasa基因的生物信息学分析33-35
• 3.3 SjVasa DEAD-BOX编码基因的扩增35-36
• 3.4 SjVasa基因的蛋白表达和纯化36-37
• 3.5 SjVasa多克隆抗体的效价检测结果37-38
• 3.6 SjVasa基因在不同时期血吸虫的表达38
• 3.7 SjVasa蛋白在不同时期血吸虫的表达38-40
• 3.8 SjVasa蛋白在虫体的定位40-41
• 4 讨论41-43
• 5 结论43-44
• 参考文献44-49
• 个人简历49-51
• 致谢51-52
• 综述52-60
• 参考文献57-60

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 何毅勋,杨惠中;日本血吸虫发育的生理学研究[J];动物学报;1980年01期

2 李石柱;郑浩;高婧;张利娟;朱蓉;许静;郭家钢;肖宁;周晓农;;2012年全国血吸虫病疫情通报[J];中国血吸虫病防治杂志;2013年06期

  本文关键词：日本血吸虫Vasa样蛋白基因的获得、表达及初步鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：314165