拟除虫菊酯噬菌体抗体库构建及基因工程抗体制备

发布时间：2017-04-17 20:19

  本文关键词：拟除虫菊酯噬菌体抗体库构建及基因工程抗体制备，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：抗体作为免疫分析的核心试剂,其制备技术一直是制约免疫分析法在农药残留分析中应用的瓶颈因素,因此寻求一种新的抗体制备方法对农残免疫分析具有重要的意义。 本研究利用噬菌体抗体库技术和基因工程技术,制备了拟除虫菊酯单链抗体,并对抗体的结构特点及其与抗原的特异性作用进行了分析。首先,从分泌拟除虫菊酯单克隆抗体的杂交瘤细胞株2G2E7中提取总RNA,并反转录成cDNA。以cDNA为模板,利用兼并引物进行PCR扩增,获得了长度约350bp的重链可变区基因和约325bp的轻链可变区基因,再经重叠延伸PCR获得了750bp左右的单链抗体(scFv)基因。经过内切酶SfiⅠ和NotⅠ对scFv和pCANTAB5E载体进行酶切、连接和热激法转化大肠杆菌TG1,最终获得了库容大小2.3×107的拟除虫菊酯初级抗体库,阳性率为100%。利用抗原对抗体库进行淘选,通过五轮淘选,有效地富集了拟除虫菊酯特异性噬菌体抗体,第五轮淘选后的噬菌体阳性率为95%；随机挑取五轮淘选后的单克隆进行测序,得到3个scFv基因。将3个基因进行PCR扩增、EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后,与pET-26b载体进行连接,成功构建重组表达载体scFv-pET26b。将重组质粒转入表达菌株BL21,最终得到3个scFv-pET26b重组表达菌株。对表达条件进行优化,经超声破碎及SDS-PAGE检测,结果显示在0.1mM IPTG,200rpm,25℃低温诱导12h条件下,3个scFv蛋白能成功表达,重组蛋白主要以包涵体的形式存在于细胞内,少量以可溶形式存在。利用间接竞争ELISA初步鉴定3个scFv的活性,结果表明：拟除虫菊酯2号单链抗体(PBAscFv2)对氰戊菊酯具有一定的结合活性,10μg/mL标品浓度下抑制率约为20%。序列分析结果显示PBAscFv2蛋白共245个氨基酸,重链123个氨基酸,轻链107个氨基酸,柔性连接肽15个氨基酸；经SOPMA软件分析,PBAscFv2二级结构中含α螺旋21处,p折叠109处,p转角23处,随机卷曲92处；利用CPH models3.2Server对PBAscFv2的空间结构进行模拟,并利用Discovery Studio2.5软件将PBAscFv2与氰戊菊酯分子进行对接,结果显示抗原抗体结合区域由三部分构成：①抗体重链高可变区CDR3区(VH-CDR3)残基Met106、Asp107、Tyr108和Trp109；②轻链框架Ⅲ区(VL-FR3)残基Thr91和Ser92；③轻链高可变区CDR2区(VL-CDR2)残基Ala41、Ser42和Pro43。 本研究的开展为拟除虫菊酯类农药基因工程抗体的制备、及其在ELISA检测方法中的应用奠定了基础。
【关键词】：拟除虫菊酯 噬菌体抗体库 单链抗体 重组表达 间接竞争酶联免疫分析
【学位授予单位】：天津科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-9
• 1 前言9-22
• 1.1 农药残留概述9-11
• 1.1.1 我国农药残留现状9
• 1.1.2 农药残留的危害9-11
• 1.2 拟除虫菊酯类农药11-12
• 1.2.1 拟除虫菊酯类农药简介11
• 1.2.2 拟除虫菊酯类农药的危害11-12
• 1.3 拟除虫菊酯类农药的检测方法12-15
• 1.3.1 分光光度法12
• 1.3.2 色谱法12-14
• 1.3.3 免疫分析法14-15
• 1.4 基因工程抗体15-18
• 1.4.1 基因工程抗体简介15-16
• 1.4.2 常见的几种基因工程抗体16-18
• 1.5 噬菌体抗体库技术18-20
• 1.5.1 噬菌体展示技术原理18-19
• 1.5.2 噬菌体抗体库的种类19-20
• 1.5.3 噬菌体抗体库应用现状20
• 1.6 研究目的及意义20-21
• 1.7 研究内容21-22
• 2 材料和方法22-44
• 2.1 材料22-28
• 2.1.1 实验用菌种及细胞22
• 2.1.2 实验用工具酶及抗生素22
• 2.1.3 实验用试剂及试剂盒22-24
• 2.1.4 实验仪器24-25
• 2.1.5 PCR所用的引物25-26
• 2.1.6 主要溶液和培养基的配置方法26-28
• 2.2 实验方法28-44
• 2.2.1 拟除虫菊酯单克隆细胞总RNA的提取28-29
• 2.2.2 拟除虫菊酯单链抗体基因的扩增29-33
• 2.2.3 噬菌体展示初级库的构建33-36
• 2.2.4 淘选36-38
• 2.2.5 噬菌体ELISA38
• 2.2.6 菌落PCR验证38-39
• 2.2.7 测序39
• 2.2.8 利用pCANTAB5E-PBAscFv-HB2151菌株表达单链抗体39-40
• 2.2.9 pET26b-PBAscFv-JM109菌株的制备40-42
• 2.2.10 利用pET26b-PBAscFv-BL21菌株表达单链抗体42-43
• 2.2.11 利用间接竞争ELISA初步鉴定单链抗体活性43
• 2.2.12 单链抗体一级结构和空间结构分析43-44
• 3 结果与讨论44-61
• 3.1 实验结果44-60
• 3.1.1 拟除虫菊酯单克隆细胞总RNA的提取44
• 3.1.2 拟除虫菊酯单链抗体基因的扩增44-46
• 3.1.3 噬菌体展示初级库的构建46-47
• 3.1.4 淘选47-48
• 3.1.5 噬菌体ELISA48
• 3.1.6 菌落PCR验证48
• 3.1.7 序列分析48-50
• 3.1.8 利用pCANTAB5E-PBAscFv-HB2151菌株表达单链抗体50-51
• 3.1.9 pET26b-PBAscFv-JM109菌株的制备51-54
• 3.1.10 利用pET26b-PBAscFv-BL21菌株表达单链抗体54-56
• 3.1.11 利用间接竞争ELISA初步鉴定单链抗体活性56-57
• 3.1.12 单链抗体一级结构和空间结构分析57-60
• 3.2 讨论60-61
• 4 结论61-62
• 5 展望62-63
• 6 参考文献63-70
• 7 致谢70

【参考文献】

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本文编号：314248