扶正清热利湿方治疗泛耐药大肠埃希氏菌尿路感染小鼠模型实验研究

发布时间：2017-04-17 20:20

  本文关键词：扶正清热利湿方治疗泛耐药大肠埃希氏菌尿路感染小鼠模型实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：尿路感染(urinary tract infection, UTI,简称尿感)是指病原体在机体内尿路中生长繁殖,侵犯尿路粘膜或组织而引起的尿路炎症,是临床上最常见的感染性疾病之一。它主要由细菌感染引起,其中以大肠杆菌最为常见。导致尿路感染的大肠杆菌又称为致病性大肠杆菌或致肾盂肾炎大肠杆菌(uropathogenic Escherichia coli,UPEC)。在本研究的前期阶段,我们针对UPEC尿路感染的发病机制及治疗方法进行了一系列研究,发现细菌耐药是临床治疗UPEC尿路感染的关键和难点。为了达到预想的结果,进一步寻找安全有效的抗生素替代治疗方案有着十分重要的现实意义,而这也正是发挥中医辨证论治优势所在。因此,寻找新的具有治疗价值的复方扶正清热利湿方已成为尿路感染研究的重要内容。扶正清热利湿方,是包含了十多种扶正清热利湿方成分的一种复方药,从中医辨证论治角度来讲,它可以达到清热利湿通淋,滋阴补肾健脾,以扶正祛邪的治疗效果。 因此,本论文以前期研究结果所筛选出的致病性强、耐药性广、生物膜阳性且产ESBL的UPEC菌株为研究对象,采用尿道插管法来建立UPEC尿路感染的小鼠模型,以扶正清热利湿方和抗生素(亚胺培南)对小鼠模型进行干预,并通过监测治疗前后小鼠的症状、体征以及各项生理指标的变化,评估扶正清热利湿方对UPEC菌尿路感染的治疗效果。最后得出结论：扶正清热利湿方对高致病、多重耐药UPEC尿路感染小鼠模型具有治疗作用,且与抗生素亚胺培南的疗效相当。 本课题主要从以下几个方面进行研究： 首先,基于实验室前期在扶正清热利湿方抗菌上的研究结果,结合国内外文献已报道的大肠杆菌毒力因子以及耐药基因的分布及作用分析结果,共挑选了95株临床分离UPEC菌株对UPEC中广泛分布的24对毒力基因进行筛选,最终得到了致病性都很强的15株UPEC菌,并对致病性都很强的15株大肠杆菌进行了有关毒力表型的相关检测及耐药谱的分析；最终得出的结论：UPEC5、UPEC10、 UPEC169菌,均出现溶血现象、其中UPEC10和UPEC169菌属生物膜阳性菌株,且常见抗生素的耐药率高,同时,UPEC10菌株还是ESBL阳性菌株,且耐药性更广。进而结合95株临床分离UPEC菌株对常见抗生素的耐药性分析其中毒力基因、耐药基因的分布及其与耐药性的内在关系；最终我们得出结论：毒力、耐药基因数与抗生素的耐药程度有显著的相关性,而且携带毒力基因越多的分离株,耐药性越强；耐药基因分布率高的产ESBL的UPEC菌株对常见抗生素的耐药性普遍很高。 其次,在构建GFP绿色荧光标记菌株过程中,关键是筛选出用于建立尿路感染模型的UPEC菌株。根据前期研究分析的结果,选用致病性强、耐药性广、生物膜阳性且产ESBL的UPEC10作为本实验研究的试验菌株；采用电转法将GFP荧光质粒转入实验菌株UPEC10中,进行抗性筛选,并在荧光显微镜下筛选荧光细菌,最终得出结论：荧光质粒已被转入到UPEC10中,荧光标记菌株UPEC10-GFP构建成功。这为后期顺利确定尿路感染模型构建是否成功以及把握尿路感染过程中小鼠体内的动态变化差异,奠定了一定的基础。 通过抗菌机制的初步研究,采用微量稀释的方法对MIC/MBC以及扶正清热利湿方的耐药性进行了检测,最终得出的结论是：扶正清热利湿方对UPEC10菌的最小抑菌浓度MIC是125mg/ml,最小杀菌浓度MBC是250mg/ml;扶正清热利湿方逆转了UPEC10菌的耐药性；于此同时,采用MTT法和微量稀释法来检测生物膜的形成以及扶正清热利湿方对生物膜形成的影响,最终得出的结论是：无论扶正清热利湿方在预先包被或不包被的情况下,扶正清热利湿方本身对生物膜的形成都具有一定的抑制作用；而生物膜的存在导致UPEC10菌对抗生素的抵抗力增强。 最后,在动物实验中,针对荧光报告UPEC10-GFP感染小鼠的浓度和剂量进行了摸索和试验,获得了最佳的菌液感染浓度和最佳剂量,并成功建立了荧光报告UPEC10-GFP菌感染小鼠模型；然后,采用扶正清热利湿方和亚胺培南(IPM)对感染成功的小鼠模型进行干预；最后,通过对其小鼠脾脏、肾脏、膀胱和尿液进行菌落计数,分析脏器中的细菌清除率,评价扶正清热利湿方对多重耐药UPEC10-GFP菌尿路感染小鼠模型的治疗作用。实验结果表明,扶正清热利湿方治疗后,各脏器中细菌计数均低于模型组和抗生素组,尿液中的细菌计数与小鼠模型脏器指数均低于模型组,但与抗生素组相当。同时,经灌胃小鼠制备的含药血清对细菌具有一定的抑菌效果。 通过以上实验,可以进一步得出结论：生物膜的存在使得UPEC耐药性增加,更加不利于细菌的生长,而扶正清热利湿方可以抑制UPEC生物膜形成,降低UPEC菌在小鼠体内的定殖和生存能力,以此,在治疗过程中,扶正清热利湿方抑制UPEC菌在脏器中寄生的能力可能会优于抗生素。通过扶正清热利湿方复方治疗法,细菌虽然仍部分存在,却可以抑制细菌在脏器中寄生,同时,通过生物膜改观,脏器炎症损伤也相应地减小。 综上所述,扶正清热利湿方对高致病、多重耐药UPEC尿路感染小鼠模型具有治疗作用,且与抗生素亚胺培南的疗效相当。通过扶正清热利湿方治疗后,又可以通过生物膜改观来减少脏器的炎症损伤。 因此,扶正清热利湿方治疗UPEC菌引起的尿道感染具有重要的现实意义；然而,扶正清热利湿方能够一定程度降低细菌的耐药性,使其对多种抗生素的敏感性增加,提示我们可能与通过消除致病菌的某些质粒有一定关系；所以,关于其逆转细菌耐药性的具体有效机制有待于进一步研究。
【关键词】：尿路感染 扶正清热利湿方 大肠埃希菌 UPEC
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R-332;R285.5
【目录】：

• 摘要7-10
• ABSTRACT10-14
• 英文缩略表14-15
• 第一章 文献综述15-21
• 1.1 尿路感染的病原菌及其耐药性的研究进展15-16
• 1.2 尿路感染的途径及其致病性的研究进展16-17
• 1.3 尿路感染的发病机制及其中药治疗的研究进展17-19
• 1.4 本课题的主要研究内容及其相关的方法研究19-21
• 第二章 引言21-23
• 1 研究背景21
• 2 研究目的和意义21-23
• 第三章 泛耐药大肠杆菌(UPEC)的毒力表型与耐药性分析23-45
• 1 材料23-24
• 1.1 实验菌株和基因23
• 1.2 抗菌药物23-24
• 1.3 主要培养基与试剂24
• 1.4 主要试剂与培养基的配制24
• 1.5 实验仪器24
• 2 方法24-29
• 2.1 毒力基因的筛选与分析24-26
• 2.2 ESBL耐药基因的筛选以及在95株UPEC临床分离菌中的分布26-27
• 2.3 95株UPEC临床分离株的耐药性分析27-28
• 2.4 毒力表型的检测与观察28
• 2.5 UPEC生物膜的形成以及对耐药性的影响28-29
• 3 结果29-41
• 3.1 毒力基因的筛选与分析29-33
• 3.2 ESBL耐药基因的筛选以及在95株临床UPEC分离菌中的分布33-34
• 3.3 95株UPEC临床分离株的耐药性分析34-36
• 3.4 毒力与耐药的关系：毒力基因分布与耐药关系36-39
• 3.5 毒力表型的检测与观察39-40
• 3.6 UPEC生物膜的形成及其对耐药性的影响40-41
• 4 分析和讨论41-45
• 4.1 95株临床UPEC分离株毒力基因分布与耐药性关系的分析41-42
• 4.2 UPEC分离菌株中ESBLs菌株的耐药性分析以及与毒力基因分布的关系42-43
• 4.3 UPEC生物膜的形成以及与耐药性的关系43-45
• 第四章 GFP绿色荧光标记菌株的构建45-49
• 1 材料45
• 1.1 实验菌株和所用试剂45
• 1.2 主要仪器45
• 2 方法45-46
• 2.1 菌株的筛选45-46
• 2.2 UPEC10的感受态细胞制备46
• 2.3 将GFP的荧光质——PS858质粒成功转入UPEC菌株46
• 3 结果46-47
• 4 分析与结论47-49
• 第五章 荧光报告UPEC小鼠模型的建立49-55
• 1 材料49
• 1.1 实验菌株与实验动物49
• 1.2 实验器械49
• 2 方法49-50
• 2.1 荧光报告UPEC10~(-GFP)菌株感染小鼠模型的最佳浓度以及感染剂量的确定49-50
• 2.2 荧光报告UPEC10~(-GFP)菌株感染小鼠模型的建立50
• 3. 结果50-52
• 3.1 荧光报告UPEC10~(-GFP)菌株感染小鼠模型的最佳浓度以及感染剂量的确定50-52
• 3.2 荧光报告UPEC10~(-GFP)菌株感染小鼠模型的建立52
• 4 分析与结论52-55
• 第六章 扶正清热利湿方和抗生素治疗感染55-65
• 1 材料55
• 1.1 实验菌株与实验动物55
• 1.2 实验器械55
• 1.3 所需试剂、药物与培养基55
• 1.4 扶正清热利湿方药物组成55
• 1.5 药物的配制与煎煮55
• 2 方法55-56
• 3 结果56-62
• 4 分析与讨论62-65
• 第七章 抗菌作用初步分析65-77
• 1 材料65-66
• 1.1 实验菌株和主要试剂65
• 1.2 实验动物65
• 1.3 主要培养基以及配制65
• 1.4 抗菌药物以及纸片65-66
• 1.5 扶正清热利湿方药物组成66
• 1.6 实验仪器66
• 2. 方法66-69
• 2.1 扶正清热利湿方对UPEC10菌的体外抑菌/杀菌作用66-67
• 2.2 扶正清热利湿方的作用下,UPEC10耐药性变化的分析67
• 2.3 扶正清热利湿方对UPEC生物膜形成的影响67-68
• 2.4 扶正清热利湿方作用下,UPEC10菌对抗生素的敏感性变化的实验68
• 2.5 含药血清抑菌作用分析68-69
• 3 结果69-75
• 3.1 扶正清热利湿方对UPEC10菌的体外抑菌/杀菌实验结果69
• 3.2 扶正清热利湿方的作用下,UPEC10耐药性变化的分析69-71
• 3.3 扶正清热利湿方对UPEC生物膜形成的影响71-73
• 3.4 扶正清热利湿方作用下,UPEC10菌对抗生素的敏感性变化的实验73-75
• 3.5 含药血清抑菌作用分析75
• 4 分析与讨论75-77
• 第八章 结论与展望77-79
• 参考文献79-85
• 致谢85-87
• 在读期间发表论文情况87

【参考文献】

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本文编号：314251