斑马鱼内毒素炎症模型建立及中药抗内毒素炎症活性筛选研究

发布时间：2017-04-18 14:03

  本文关键词：斑马鱼内毒素炎症模型建立及中药抗内毒素炎症活性筛选研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景 内毒素(LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁的组成成分,可直接或间接引起机体发热、代谢改变、免疫功能紊乱,多器官功能损害、休克乃至死亡等许多病理生理过程。目前针对由内毒素触发的全身炎症反应综合征或脓毒症的治疗尚无特殊有效的措施,仍以糖皮质激素加对症治疗为主,寻找拮抗内毒素的措施一直是基础医学与临床医学努力的方向。近十几年来,从中药及天然产物中寻找抗内毒素方法亦为关注的热点,一些中药、复方或其所含成分被证明对受内毒素攻击的动物有保护作用。凉膈散(载宋《和剂局方》)作为温病治疗常用名方,主要用于治疗感染、炎症等。方中重用连翘,清热解毒,以清除上焦无形之邪热,功专量重,是为君药。配黄芩以清胸膈郁热：大黄泻火通便,以荡有形之热于中,共为臣药。现代药理研究亦证实组成该方的主要单味药连翘、大黄、黄芩等都有不同程度的抗内毒素作用。 目前,对急症医学、抗炎免疫药物研发显得尤为重要的是寻找合适的动物模型进行抗内毒素药物筛选。而斑马鱼对此具有丰富的前景：体小,产卵量高,繁殖周期短,成本低；体外受精,发育全程透明,可实时观察病原体和损伤。此外,斑马鱼属于脊椎动物,其免疫系统与人类极为相似。斑马鱼作为理想的抗内毒素炎症药物筛选模型主要在于拥有先进的基因技术和大量的转基因系。比如,利用Tg(mpo:GFP)系可实时活体观测幼鱼中性粒细胞的生物学行为。这是其它脊椎动物所无法实现的。 本文为国家自然科学基金“凉膈散对内毒素急性肺损伤肺组织水液转运的影响及机制研究”和广州市科技计划项目“凉膈解毒胶囊临床前药理及抗内毒素药效评价关键技术研究”的部分研究工作。在前述相关研究基础上,发挥斑马鱼在抗炎免疫药理研究及药物筛选方面的特色与优势,建立方便、快捷的中药抗内毒素活性筛选体系,并利用该体系对凉膈散方中部分成分的抗内毒素活性进行筛选,从转基因系、细胞化学水平、基因水平揭示该方抗内毒素作用的物质基础。 研究目的与意义 目的：建立斑马鱼内毒素炎症模型,探讨中药抗内毒素炎症活性筛选新方法,并在此基础上研究凉膈散方中活性成分连翘酯苷A、连翘苷、大黄素、黄芩苷对斑马鱼内毒素炎症模型的保护作用。意义：构建斑马鱼内毒素炎症模型,为研究人类炎症免疫疾病相关的病理生理机制及在活体内进行快速药物筛选提供新的技术平台；利用马鱼内毒素炎症模型,建立一个介于体外初筛与哺乳动物验证之间的快速、低成本的中药抗内毒素活性筛选新方法,具有良好应用前景。 研究方法 1.脂多糖(LPS)诱导斑马鱼炎症模型的构建 1.1.LPS染毒方式选择不同方式(浸泡、显微注射)同样给予相同浓度LPS,观察炎症表型变化；经中性红染色、苏丹黑B染色观察巨噬细胞、中性粒炎症迁移聚集情况；使用中性粒细胞转基因斑马鱼(mpo:GFP),结合活体成像系统实时监测中性粒细胞炎症迁移过程；观察荧光下炎症表型变化,统计存活情况,比较死亡率和生存时间(Kaplan-Meier曲线法)。 1.2.LPS染毒时间(鱼龄)选择将不同发育时期的幼鱼(3天、5天、6天)显微注射相同浓度LPS,统计存活情况,比较死亡率和生存时间(Kaplan-Meier曲线法)。 1.3.LPS染毒剂量选择将不同浓度的LPS (0.5,0.4,0.25mg/ml)显微注射到一定时期的幼鱼中,统计存活情况,比较死亡率和生存时间(Kaplan-Meier曲线法)。在此基础上进行半数致死浓度LD5o的测定。 2.基于斑马鱼内毒素炎症模型的抗内毒素中药活性筛选及其药效评价方法研究——连翘酯苷A、连翘苷、大黄素、黄芩苷对斑马鱼内毒素炎症模型的保护作用 将3dpf随机分为阴性对照组(PBS)、LPS组、LPS+3个不同剂量连翘酯苷A组(LPS+FA)、LPS+3个不同剂量连翘苷组(LPS+PHN)、LPS+3个不同剂量大黄素组(LPS+EDN)、LPS+3个不同剂量黄芩苷组(LPS+BAN)、地塞米松阳性对照(LPS+DEX)。造模后,各单体以浸泡给药方式进行抗炎活性筛选及其药效评价：用Kaplan-Meier曲线法分析各用药组对斑马鱼存活率及生存时间的影响,据此确定给药浓度后,重点观察给药后不同时间点的白细胞聚集程度(转基因系Tg(coro la:GFP;lyz:Dsred)或Tg(mpo-GFP)示踪)、中性粒细胞数量(苏丹黑B染色后进行中性粒细胞计数)及促炎介质TNF-α IL-1β\IL-6的表达(RT-PCR法)。 主要研究结果 1.LPS诱导斑马鱼炎症模型的构建 1.1.染毒方式选择 我们采用显微注射LPS到3天受精卵(days post-fertilization, dpf)的卵黄囊中(每组34条鱼),发现注射0.5mg/ml LPS (2nl每条鱼)24h后能导致严重的畸形：卵黄坏死(22.0±0.9%)、脊椎弯曲(30.7±0.2%)、心包水肿(4.6±0.5%)、心胞膜出血(12.6±0.5%)、死亡(34.0±1.5%),其中卵黄坏死、死亡是其严重感染的表型,且随着观察时间延长,幼鱼的感染更严重。相反,0.5mg/ml LPS浸泡组在24h内没观察到任何异常表型。 中性红和苏丹黑B染色结果显示,LPS浸泡组无明显的巨噬细胞和中性粒细胞聚集区,出现聚集的斑马鱼数分别占总观察数的0%和3.3%；而LPS显微注射组在注射位点卵黄囊上可观察到巨噬细胞和中性粒细胞大量聚集,出现聚集的斑马鱼数分别占总观察数的96.6%和95.5%。这两种炎细胞在各实验组中的聚集率在统计学上有显著性差异(P0.00001)。 用Tg(mpo:GFP)斑马鱼示踪中性粒细胞发现,LPS卵黄注射组和PBS对照组在注射2h后可观察到中性粒细胞局部弥散在卵黄囊上；6h后PBS对照组卵黄囊上的中性粒细胞开始退回血管；而LPS卵黄注射组则成团停滞在卵黄囊上；12-16h卵黄囊上中性粒细胞成团停滞的部位变为一个边界清晰荧光圈；18-24h卵黄囊糜烂,mpo全身信号渐弱,开始出现死亡。相反,LPS浸泡组在48h内没观察到中性粒细胞异常迁移行为。 生存分析结果显示,卵黄囊显微注射LPS在32h内对斑马鱼的致死率100%,大部分在24h内出现明显的中毒表型。浸泡LPS组无明显中毒表型,45h存活率为100%；48h存活率为85.6%,剩余幼鱼直到实验结束还存活。而卵黄显微注射PBS和正常对照组在48h存活率分别为94.4%,100%。LPS卵黄显微注射组的斑马鱼存活率和生存时间显著低于LPS浸泡组(P0.0001)。 1.2.LPS染毒时间(鱼龄)选择 3dpf在注射LPS后32h内致死率为100%,5dpf、6dpf在48h内致死率均为94%,剩余幼鱼直到实验结束还存活。而PBS对照存活率为100%。3dpf、5dpf、6dpf的中位生存时间分别为20、25、36h,3种注射时间的生存时间有显著性差异P0.001)。 1.3.LPS染毒剂量选择 随着注射LPS浓度降低,实验组内胚胎致死率也随之下降,呈剂量依赖性。LPS半数致死浓度LDso为297.61μg/ml(95%可信区间为287.711-307.331)；致死浓度LD99为542.641μg/ml(95%可信区间为503.377-598.246)。 2.基于斑马鱼内毒素炎症模型的抗内毒素中药活性筛选及其药效评价方法研究——连翘酯苷A、连翘苷、大黄素、黄芩苷对斑马鱼内毒素炎症模型的保护作用 2.1.各单体给药组对LPS感染的斑马鱼存活率的影响 与LPS模型组相比,经2,4,8μg/ml连翘酯苷A、1,3.3,10μg/ml连翘苷、0.055,0.11,0.22μg/ml大黄素、1.25,2.5,5μg/ml黄芩苷治疗均能明显延长斑马鱼生存时间,提高存活率(均有P0.001),且存在剂量依赖性。其中以8μg/ml连翘酯苷A,10μg/ml连翘苷,5μg/ml黄芩苷药效较明显,从存活率及生存时间两方面均优于其它浓度治疗组(分别与另两个浓度组相比,均有P0.05)。与另两个浓度组相比,0.22μg/ml大黄素虽有较高的存活率和明显延长的生存时间,但仅与0.055μg/ml存在显著性差异(P0.05),与0.11μ/ml大黄素不存显著性差异(P0.05)。据此,我们以8μg/ml连翘酯苷A,10μg/ml连翘苷,0.22μg/ml大黄素,5μg/ml黄芩苷,5μg/ml地塞米松作为浸泡给药浓度。 2.2.各单体给药组对不同时间点的白细胞炎症聚集和组织坏死的影响 利用转基因系或苏丹黑B染色观察发现,与白细胞明显募集卵黄注射位点的LPS组相比(3度炎症募集为主,无坏死),在注射6h后PBS阴性对照组,地塞米松,8μg/ml连翘酯苷A,10μg/ml连翘苷,0.22μg/ml大黄素,5μg/ml黄芩苷的白细胞只有少量零散分布(1-2度炎症募集,无坏死)。注射后12h,PBS阴性对照组与正常对照组相似,注射位点——卵黄上无或只有少数几个炎细胞募集(1度炎症募集,无坏死),除LPS组中白细胞大量募集卵黄外(4度炎症募集为主,出现少量坏死),各单体治疗组卵黄只有少量白细胞零散分布(2度炎症募集为主)。随着时间增加LPS组感染程度明显加重,24h后LPS组中几乎所有鱼卵黄都呈现出畸形和大面积坏死(5度炎症募集为主,严重坏死),各单体治疗组白细胞募集虽有所增多,但注射位点没出现坏死或只有个别鱼卵黄注射位点出现小面积坏死(3,4度炎症募集为主)。 2.3.各单体给药组对不同时间点的中性粒细胞产生和迁移的影响 对于PBS对照组,卵黄囊中性粒细胞数在注射后6h达峰后开始减少,12、24h卵黄上几无中性粒细胞；而腹主动脉中性粒细胞数于注射后6h开始增加,且总体中性粒细胞数在3h后一直保持稳定数量。与PBS对照相比,注射LPS后1、3、6、12h斑马鱼总体中性粒细胞数量大量增加(n=10,P0.001)；其中腹主动脉中性粒细胞在1、3h大量产生后于6、12h逐渐减少；卵黄囊的中性粒细胞数在1、3、6随时间推移不断增加(均有P0.001),6h达高峰后数量开始下降,但12h时不管是总体数量还是卵黄中的数量仍高于PBS组(均有P0.001)。24h后LPS组中卵黄囊注射位点可见明显畸形和坏死,总体中性粒细胞数、卵黄囊的中性粒细胞数及腹主动脉的中性粒细胞数均出现急剧减少(均有P0.001)。在感染的早期(1-12h),10μg/ml连翘苷,8μg/ml连翘酯苷A,0.22μg/ml大黄素,5μg/ml黄芩苷治疗组对LPS所致的中性粒细胞大量产生,激活及炎性迁移均有明显的抑制作用(均有P0.05)。在感染的晚期(24h),各单体治疗组均能明显抑制中性粒细胞的大量减少和组织坏死(均有P0.05)。 2.4.各单体给药组对不同时间点的促炎介质TNF-α、IL-1β、IL-6的表达的影响 注射后6-24h,与PBS组相比,LPS感染的斑马鱼其IL-1β,IL-6和TNF表达均显著增加(P0.05)。IL-1β对LPS感染呈现出速发型应答,6hpi已高于PBS对照组13倍,18hpi达最高值30倍。LPS组的IL-6表达情况与IL-1β相似,不同的是IL-6随着时间增加表达量不断增加,最高值时间在24hpi。对于TNF-α,其表达水平在这几个时间点上上调幅度不如IL-1β和IL-6大,但各时间点仍明显高于PBS组。在6-18h内,各单体治疗组均能明显抑制LPS介导的TNF-α,IL-1β,IL-6表达上调(均有P0.05),而在注射后24h则只观察到对IL-6增加仍有抑制作用。 结论 1.选择3dpf斑马鱼,以0.5mg/mlLPS浓度,采用卵黄显微注射染毒方式,可作为建立炎症模型的参考条件；在显微镜下实时活体观察LPS诱导的白细胞的迁移聚集情况、斑马鱼死亡率、生存时间可作为筛选抗内毒素炎症活性参考指标。 2.凉膈散方中活性成分连翘酯苷A、连翘苷、大黄素、黄芩苷均有抗内毒素炎症作用。其作用机制可能与抑制LPS激活巨噬细胞和中性粒细胞而减少白细胞的产生及炎性迁移,抑制促炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达,从而调控急性炎症反应的进程有关。连翘苷、连翘酯苷A、大黄素、黄芩苷可作为进一步研究的抗内毒素疾病候选药物。
【关键词】：斑马鱼 内毒素 连翘苷 连翘酯苷A 大黄素 黄芩苷
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R-332;R284
【目录】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-21
• 第一章 前言21-28
• 1.1 内毒素生物效应及抗内毒素治疗研究概况21-22
• 1.2 斑马鱼研究概况及在抗内毒素中药筛选中的优势22-27
• 1.3 本文主要研究工作及意义27-28
• 第二章 斑马鱼内毒素炎症模型构建28-48
• 2.1 材料与方法28-31
• 2.2 实验结果31-46
• 2.3 讨论46-47
• 2.4 本章小结47-48
• 第三章 基于斑马鱼内毒素炎症模型的抗内毒素中药活性筛选及其药效评价方法研究48-84
• 3.1 连翘酯苷A对斑马鱼内毒素炎症模型的保护作用48-64
• 3.2 连翘苷对斑马鱼内毒素炎症模型的保护作用64-74
• 3.3 大黄素、黄芩苷对斑马鱼内毒素炎症模型的保护作用74-82
• 3.4 本章小结82-84
• 结语84-86
• 附录86-88
• 参考文献88-96
• 成果96-97
• 致谢97-98

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本文编号：315018