酵母双杂交技术筛选CT813配体的研究

发布时间：2017-04-19 08:41

  本文关键词：酵母双杂交技术筛选CT813配体的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis, CT）是一类严格活细胞内生长，具有独特二相发育周期的原核微生物，发育周期即原体→始体→原体，原体代谢能力弱但感染性强，始体代谢能力强但没感染性。沙眼衣原体主要引起沙眼疾病，是全球致盲的首要病因；可通过性传播途径，，引起人类泌尿生殖道感染；也可侵犯腹股沟淋巴结，引起化脓性淋巴结炎和慢性淋巴肉芽肿，严重危害人类健康。 CT的生物合成和装配是包涵体内进行的，包涵体不仅为沙眼衣原体复制提供微环境，而且保护CT免遭宿主免疫系统的识别和清除。另外包涵体膜是CT从宿主细胞中摄取营养和代谢的中间产物以及信号变换的必经之路。包涵体膜的主要组成成分是由CT基因编码、表达于包涵体膜上的蛋白质即包涵体膜蛋白。自从Rochey等【1995年】用实验首次证实衣原体通过转位其自身基因编码的蛋白到包涵体膜上以来，不断有新的包涵体膜蛋白被鉴定出来。根据已经鉴定的膜蛋白的疏水性特性，计算机辅助程序预测出36个CT基因编码的蛋白为候选包涵体膜蛋白。CT813是被预测并经过证实的包涵体膜蛋白之一，但对CT813的具体生物学功能尚不清楚，为此我们用酵母双杂交技术寻找与CT813相互作用的蛋白，以期为进一步深入研究CT813的生物学特性及阐述沙眼衣原体的致病机制提供重要信息。 首先，根据STD基因库（www.stdgen. lanl. gov）提供信息设计引物，用PCR法从沙眼衣原体的D型菌株中获取目的基因片段CT813，用限制性内切酶Sma I和Pst I酶切处理CT813和pGBKT7质粒，经T4连接酶连接，转入感受态细胞E.coli, BL-21中培养。用菌落PCR、Sma I/Pst I双酶切验证后，对确认的阳性质粒进行测序，使用BLAST软件比对分析。将构建成功的诱饵质粒转入酵母菌株AH109和Y187中，经检证无自激活和细胞毒性作用。 以pGBKT7-CT813作为诱饵质粒与HeLa细胞酵母GAL4AD融合cDNA文库进行酵母双杂交实验。待三叶草（或米奇）形状合子形成后，涂布于缺腺嘌呤、组氨酸、亮氨酸、色氨酸缺陷型培养基并铺有X-Gal（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-Gal）的平板上初筛，经过3次筛选收集阳性菌落。把阳性菌液点种在滤纸上，在液氮中反复冻融3次，然后浸泡在Z缓冲液-β巯基乙醇-X-Gal混合液中室温温育8h。筛选出的阳性菌液进行PCR验证。将克隆阳性的菌液提取质粒进行回交实验验证。对阳性质粒进行碱基序列测定，经BLAST比对检测其同源蛋白，确定筛选基因。经过检索比对得出与pGBKT7-CT813特异性相互作用的蛋白有：半乳糖凝集素-1（LGALS1）、环腺苷酸应答原件结合蛋白3（CREB3）、核糖体核糖体蛋白L10a（RPL10a）、微管蛋白37E-16（RP1-37E16）。
【关键词】：cDNA文库 HeLa细胞 包涵体膜蛋白 诱饵载体 酵母双杂交
【学位授予单位】：河北北方学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R374.1;R3416
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 英文缩写8-10
• 前言10-12
• 材料与方法12-27
• 结果27-29
• 附图29-39
• 附表39-40
• 讨论40-44
• 结论44-45
• 参考文献45-51
• 综述51-59
• 参考文献55-59
• 致谢59-60
• 个人简历60

【参考文献】

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1 周丽娜;吴军;罗高兴;贺伟峰;陈希炜;柏甘萍;石东文;王庆红;袁顺宗;张小容;胡晓红;;Foxp3酵母双杂交诱饵表达载体的构建、鉴定和其毒性及自激活效应检测[J];第三军医大学学报;2006年08期

2 ;Screening of FOXP3-interacted proteins by yeast two-hybrid technique[J];Journal of Medical Colleges of PLA;2008年02期

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本文编号：315817