CRMP5与微管相互作用调节生长锥发育的研究

发布时间：2017-04-20 13:00

  本文关键词：CRMP5与微管相互作用调节生长锥发育的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的： 探讨CRMP5是否能与微管发生相互作用，以及如何影响神经元生长锥的发育。 方法： 首先构建CRMP5-GST原核质粒并体外表达CRMP5融合蛋白，体外进行pulldown实验，分析CRMP5在体外是否与微管相互作用；然后构建CRMP5-FLAG及tubulin-GFP真核质粒共同转染293T细胞，提取转染后293T细胞裂解液进行CoIP实验，大鼠脑组织裂解液并提取生长锥进行CoIP实验，检测CRMP5在体内是否与微管结合；进而用免疫荧光染色结合共聚焦显微镜观察CRMP5和tubulin在293T细胞与神经元中的定位情况；最后将原代培养的海马神经元过表达和敲除CRMP5基因，观察神经元生长锥的变化。 结果： (1)构建的重组质粒酶切鉴定结果显示，酶切条带大小与预期的相符，CRMP5的真核原核重组质粒与tubulin真核重组质粒测序结果与预期的序列完全吻合，无突变发生； (2)原核表达系统表达出相应的CRMP5-GST融合蛋白，融合蛋白分子量大约90kDa，与预期大小一致； (3)用体外表达纯化的CRMP5-GST融合蛋白与脑组织蛋白提取液进行的pulldown，体外实验结果显示，CRMP5-GST融合蛋白可以成功层析出微管蛋白； (4)共同过表达CRMP-5与tubulin的293T细胞裂解液，大鼠脑组织蛋白提取液及大鼠脑组织提取的生长锥分别进行的CoIP实验，结果同样显示CRMP5可以成功层析出微管蛋白； (5)免疫细胞化学结果显示，CRMP5与tubulin共存于293T细胞的胞体和伪足，神经元的胞体、突起和生长锥，与体内外的结合实验结果相吻合； (6)原代培养的海马神经元敲除CRMP5基因，神经元的生长锥发育明显受到抑制； (7)原代培养的海马神经元过表达CRMP5基因，，可明显促进神经元生长锥的发育。 结论： (1)成功构建了CRMP5-GST、CRMP5-FLAG和tubulin-GFP原核及真核表达载体； (2)体外成功表达了CRMP5-GST融合蛋白； (3) CRMP5在体内外均可与微管发生结合； (4) CRMP5与微管共存于293T细胞的胞体和伪足，神经元的胞体、突起和生长锥等处； (5) CRMP5可能通过与微管相互作用参与神经元生长锥的发育。
【关键词】：坍塌反应调节蛋白 微管 神经元 生长锥 相互作用
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R338
【目录】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 第一章 前言9-18
• 1.1 生长锥与神经元的发育9-11
• 1.2. 微管与神经元突起生长11-13
• 1.2.1 微管的结构特点11-12
• 1.2.2 生长锥微管运动与突起生长12-13
• 1.3. CRMPs 家族13-16
• 1.3.1 CRMPs 的生物学特点13-14
• 1.3.2 CRMPs 的空间表达特征14-15
• 1.3.3 CRMPs 与神经元突起生长的关系15-16
• 1.3.4 CRMPs 与疾病16
• 1.4. 研究目的及其意义16-18
• 第二章 实验材料和方法18-39
• 2.1 实验材料18-23
• 2.1.1 实验动物18
• 2.1.2 细菌菌株、细胞株18
• 2.1.3 主要试剂、工具和试剂盒18-20
• 2.1.4 一般试剂的配制20-22
• 2.1.5 主要的仪器设备22-23
• 2.2 试验方法23-38
• 2.2.1 RT-PCR23-24
• 2.2.2. 反转录反应 (RT)24-25
• 2.2.3. PCR 反应25-26
• 2.2.4 构建 CRMP5-GST、CRMP5-FLAG 和 Tubulin-GFP 的重组原核、真核表达载 体26-28
• 2.2.5 293T 细胞的培养28-30
• 2.2.6 CRMP5-GST 融合蛋白与 Tubulin 的 Pulldown 分析及免疫印迹（Western Blot） 检测30-34
• 2.2.7 CRMP5 与 tubulin 免疫荧光共定位34-35
• 2.2.8 CRMP5 与 tubulin 免疫共沉淀（coIP）分析及检测35-37
• 2.2.9 生长锥的提取37-38
• 2.2.10 siRNA 的设计及合成38
• 2.3 数据统计与分析38-39
• 第三章 结果与分析39-49
• 3.1 构建 Tubulin-GFP、CRMP5-FLAG 和 CRMP5-GST 的原核和真核重组表达载体39-40
• 3.2 CRMP-5-GST 融合蛋白和 tubulin GST Pulldown 分析40-42
• 3.2.1 CRMP-5-GST 融合蛋白的诱导表达，考马斯亮蓝染胶图40-41
• 3.2.2 胎鼠脑组织生长锥的提取41
• 3.2.3 CRMP5 和 Tubulin 的 Pulldown 分析41-42
• 3.3 CRMP5 和 Tubulin 的 CoIP 分析42-43
• 3.4 CRMP-5 和 Tubulin 免疫荧光共定位43-45
• 3.4.1 CRMP-5 和 Tubulin 在 293T 细胞中免疫荧光共定位43-44
• 3.4.2 CRMP5 和 Tubulin 在神经元及生长锥中免疫荧光共定位44-45
• 3.5 干扰和过表达 CRMP5 对神经元生长锥发育的影响45-49
• 3.5.1 干扰 CRMP-5 对神经元的生长发育的影响46-47
• 3.5.2 过表达 CRMP-5 对神经元的生长发育的影响47-49
• 第四章 讨论49-52
• 第五章 结论52-53
• 参考文献53-60
• 附录：英文缩写词60-61
• 在读期间发表论文61-62
• 致谢62

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 李建农,蒋建东;微管的生物学特性与药物研究[J];药学学报;2003年04期

  本文关键词：CRMP5与微管相互作用调节生长锥发育的研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：318695