伤寒沙门菌质粒对不同状态下细菌毒力和E.coli体内生物膜形成的影响

发布时间：2017-04-20 17:26

  本文关键词：伤寒沙门菌质粒对不同状态下细菌毒力和E.coli体内生物膜形成的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：在自然界细菌以单个游离悬浮状态和生物膜（biofilm，BF）状态两种形式存在。与浮游细菌相比，处于BF状态的细菌对不利条件，如干燥、极端温度、抗菌药物和消毒剂的抵抗力均明显增强。感染了BF的机体和污染了BF的生物材料，即使应用正常剂量数百倍的抗菌药物也难以奏效，因而常导致迁延难治性感染或严重公共卫生事件。伤寒沙门菌质粒pRST98是一种同时编码细菌耐药性和毒力的“嵌合性”质粒，在实验室和小鼠体内很容易通过接合作用从伤寒沙门菌（Salmonella typhi, S. typhi, ST）传递至鼠伤寒沙门菌（Salmonella typhimurium, S.typhimurium, STM）、大肠埃希菌（Escherichia coli, E. coli）和痢疾杆菌等，且这些细菌彼此之间还可互相传递，导致宿主菌耐药性和毒力增强。由于伤寒沙门菌只感染人类，没有合适的动物模型，因此在本课题中，通过接合转移将pRST98分别转移至受体菌形成接合子STM/pRST98和E. coli/pRST98进行研究。本研究第一部分探讨伤寒沙门菌质粒对不同状态下细菌毒力的影响，比较受试菌STM，STM/pRST98，E. coli和E. coli/pRST98在浮游状态和BF状态下，细菌粘附侵袭、抵抗血清杀菌和巨噬细胞吞噬能力的的差异。本研究第二部分以E. coli和E.coli/pRST98为研究对象，通过构建小鼠泌尿道插管模型，研究伤寒沙门菌质粒pRST98对E. coli在小鼠体内形成BF的影响。 方法： 一、伤寒沙门菌质粒对不同状态下细菌毒力的影响 1.不同状态下细菌菌液的准备 按常规方法将受试菌STM, STM/pRST98, E. coli和E. coli/pRST98增菌，制备单个游离悬浮状态的细菌菌液；将受试菌分别在常规条件下培养3d形成成熟BF，使用超声法将BF中的细菌均匀分散后，制备BF状态下的菌液。将游离细菌与BF细菌使用OD法和平板菌落计数法（colony-forming unit, CFU）确定浓度后，分别与小鼠结肠癌细胞CT26进行粘附侵袭、血清杀菌以及抗巨噬细胞吞噬实验，分别比较不同状态下受试菌毒力的差异以及pRST98对不同状态下宿主菌毒力的影响。 2.伤寒沙门菌质粒对不同状态下细菌粘附和侵袭CT26细胞的影响 将实验菌株STM, STM/pRST98, E. coli和E. coli/pRST98按感染复数（multiplicityof infection, MOI）100:1与CT26细胞共培养1h后，弃去菌液后用PBS洗涤细胞，破膜后用CFU比较受试菌对细胞的粘附力。侵袭实验与粘附实验基本相同，但在细菌细胞共培养1h后弃去菌液用PBS洗涤3次后每孔加入含阿米卡星（100μg/ml）的细胞培养液，作用3h后进行细胞内活菌计数。 3.伤寒沙门菌质粒对不同状态下细菌抵抗血清杀菌能力的影响 用OD法和CFU法将不同状态的受试菌稀释至1×104CFU/ml，吸取20μl菌液分别加入含不同稀释度的兔和豚鼠血清0.2ml的试管，不含血清的普通肉汤管做CFU对照，根据预实验结果选择37℃，2h作为杀菌作用时间。用平板菌落计数法计算存活细菌数。 4.伤寒沙门菌质粒对不同状态下细菌抵抗巨噬细胞吞噬杀伤的影响 STM作为兼性厌氧胞内菌，可在巨噬细胞内存活。用OD法和CFU法将浮游状态和BF状态下受试菌浓度调整至107CFU/ml待用。用血细胞计数板计数后将小鼠巨噬细胞J774A.1细胞浓度调整至5×105个/ml，分别加入6孔板，每孔1ml。将1ml不同状态的受试菌加入到各孔中，与细胞共作用1h。用含阿米卡星（100μg/ml）的RPMI1640培养液离心洗涤除去胞外菌，重新悬浮于含阿米卡星的培养液中，在不同时间点裂解细胞做CFU检测胞内活菌数。 二、伤寒沙门菌质粒对E. coli体内生物膜形成的影响 1.小鼠泌尿道插管模型的制备 PE10塑料导管经消毒处理后分别于1×107CFU/ml的E. coli和E. coli/pRST98菌液中浸润24h，使受试菌粘附于导管表面。雌鼠进行麻醉、固定及消毒后，将准备好的PE10导管插入小鼠尿道并轻推至膀胱中。根据感染细菌的不同将小鼠分为两组，每组6只，实验重复3次。 2.比较E. coli和E. coli/pRST98在体内形成BF的差异 （1）激光共聚焦扫描显微镜（Confocal laser scanning microscope， CLSM）观察导管表面BF的形成 感染后第5d小鼠经麻醉处死，将PE10导管从体内取出后用PBS洗涤，置于适量浓度为0.01%的吖啶橙染液中，于黑暗中静置染色10min再用PBS洗涤，将染色的导管置于载玻片上镜下观察。 (2)扫描电镜（Scanning electron microscopy, SEM）观察导管表面生物膜的形成 将插管后第5天的小鼠麻醉后处死，取出膀胱中的PE10导管，用PBS轻柔洗涤，用2.5%的戊二醛溶液固定，用0.1mol/L的磷酸盐缓冲液漂洗后，用1%锇酸后固定1h，再用连续梯度的叔丁醇溶液脱水，将导管取出进行临界点干燥和镀金后于SEM下观察导管表面BF的形态。 (3)生物膜CFU计数 按上述方法取得导管后，经PBS轻柔漂洗后置于1.0ml PBS超声振动20min，使生物膜中的细菌均匀分散至溶液中，进行CFU计数生物膜中的活菌数量。 3.受试菌感染后小鼠脏器的变化 插入导管后第8d经麻醉处死小鼠，肉眼观察小鼠的肝脏、肾脏和脾脏的病变。取其肝脏和肾脏固定于10%的甲醛中，经乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋等步骤，切片经HE染色后于显微镜下观察。 结果： 一、伤寒沙门菌质粒对不同状态下细菌毒力的影响 1.伤寒沙门菌质粒对不同状态下受试菌粘附和侵袭的影响 实验结果显示除E. coli外，各受试菌在BF状态下对细胞的粘附力明显增强，在BF状态和浮游状态下，pRST98对宿主细菌的粘附力无明显影响（p0.05）。在两种不同状态下，与E. coli相比，STM对CT26细胞的粘附力更强。侵袭实验结果表明，形成BF后STM对CT26细胞的侵袭力明显下降(p 0.01)，E. coli组，也有相似趋势(p 0.05)。另外，pRST98在BF和浮游状态下对宿主菌侵袭CT26细胞的能力均无明显影响。STM对CT26细胞的侵袭能力强于E. coli(p 0.05)。 2.伤寒沙门菌质粒对不同状态下受试菌抵抗血清杀菌能力的影响 BF状态的受试菌STM, STM/pRST98, E. coli和E. coli pRST98在兔血清和豚鼠血清中的存活率均高于浮游状态的受试菌(p 0.05)。在BF状态下，STM/pRST98和E.coli pRST98抗兔血清和豚鼠血清杀菌能力亦分别明显高于STM和E. coli(p 0.05)。STM对血清杀菌的抵抗力显著高于E. coli(p 0.05)。 3.伤寒沙门菌质粒对不同状态下受试菌抵抗巨噬细胞吞噬杀伤的影响 BF状态下的STM在巨噬细胞内的存活率明显高于浮游状态下的细菌，说明在BF状态下细菌抗巨噬细胞吞噬能力增强，差异有统计学意义（p 0.05）。另外，可以发现BF和浮游状态下，STM pRST98在巨噬细胞内的存活率均高于STM（p 0.05）。 二、伤寒沙门菌质粒对E. coli体内生物膜形成的影响 1.比较E. coli和E. coli/pRST98在体内形成BF的差异 成功建立小鼠插管模型。小鼠插管后活动正常，麻醉后处死小鼠从小鼠膀胱中取出导管。插管后第5d，E. coli和E. coli/pRST98可以在导管上形成BF，通过CLSM可以观察到E. coli/pRST98在导管表面形成的BF荧光信号明显强于E. coli。SEM下观察导管表面形成的生物膜发现，E. coli/pRST98感染组细菌聚集成团，形成成片的BF，，而E. coli感染组细菌只是散落分布于导管表面不能形成明显的BF。CFU定量检测导管表面活菌数结果显示，E. coli/pRST98在导管上的定值数量明显高于E. coli（p 0.05）。 2.受试菌感染后小鼠脏器的变化 E. coli/pRST98感染组小鼠皮毛黯淡，精神萎靡，活动迟缓。感染后第8d将小鼠麻醉处死解剖后见小鼠肝脏、肾脏和脾脏明显充血肿大，表面有多发性小脓肿；病理切片HE染色后见小鼠肝脏细胞浊肿，肝小叶结构破坏且有炎性细胞浸润，肾脏有大量淋巴细胞浸润，肾小球结构破坏。E. coli感染组小鼠皮毛、精神及活动均正常，感染后第8d将小鼠麻醉处死解剖后见小鼠肝脏、肾脏和脾脏稍肿大，但无多发性小脓肿；病理切片HE染色可见小鼠肝细胞水样变性和炎症细胞浸润，肾脏细胞水样变性及淋巴细胞浸润。 结论： 1. BF的形成在促进细菌对小鼠结肠癌细胞CT26粘附的同时降低了细菌对细胞的侵袭。 2. BF形成能显著增强细菌抵抗血清杀菌和巨噬细胞吞噬的能力，使毒力增强。 3.伤寒沙门菌质粒pRST98能增强浮游和BF状态下STM和E. coli对血清杀菌和巨噬细胞吞噬的抵抗力。 4.伤寒沙门菌质粒pRST98能促进E. coli在小鼠体内形成BF。
【关键词】：鼠伤寒沙门菌 大肠埃希菌 生物膜 伤寒沙门菌质粒 小鼠模型
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R378.22
【目录】：

• 中文摘要4-9
• Abstract9-14
• 第一部分 伤寒沙门菌质粒对不同状态下细菌毒力的影响14-29
• 前言14-16
• 1 材料与方法16-22
• 1.1 材料16-19
• 1.2 方法19-22
• 2 结果22-26
• 2.1 伤寒沙门菌质粒对不同状态下受试菌粘附 CT26 细胞的影响22
• 2.2 伤寒沙门菌质粒对不同状态下受试菌侵袭 CT26 细胞的影响22-23
• 2.3 伤寒沙门菌质粒对不同状态下受试菌抵抗血清杀菌能力的影响23-25
• 2.4 伤寒沙门菌质粒对不同状态下细菌抵抗巨噬细胞吞噬杀伤的影响25-26
• 3 讨论26-29
• 第二部分 伤寒沙门菌质粒对 E. coli 体内生物膜形成的影响29-39
• 1 材料与方法30-33
• 1.1 材料30-31
• 1.2 方法31-33
• 2. 结果33-36
• 2.1 CLSM 观察导管表面细菌生物膜的形成33
• 2.2 SEM 观察导管表面细菌细菌生物膜的形成33-34
• 2.3 生物膜 CFU 计数34-35
• 2.4 受试菌感染后小鼠脏器的变化35-36
• 3 讨论36-39
• 小结39-40
• 参考文献40-44
• 综述44-60
• References54-60
• 英文缩略词表60-61
• 攻读学位期间公开发表的论文61-62
• 本课题所获基金资助62-63
• 致谢63-64

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 黄瑞，穆荣谱;伤寒沙门氏菌耐药性及其耐药质粒的监测[J];中华传染病杂志;1994年04期

  本文关键词：伤寒沙门菌质粒对不同状态下细菌毒力和E.coli体内生物膜形成的影响，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：319189