人脐血内皮祖细胞的分离、培养和鉴定及改良冻融法脱细胞血管支架的建立

发布时间：2017-04-21 09:03

  本文关键词：人脐血内皮祖细胞的分离、培养和鉴定及改良冻融法脱细胞血管支架的建立，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：血管疾病是目前全球发病率最高的疾病之一，可由动脉粥样硬化、创伤、血管瘤以及各种先天性异常等因素引起，而主要治疗方法与手段是血管移植术。据统计，在美国每年欲进行移植血管行动脉旁路术就高达10万例以上。因此，如何进一步扩大血管移植物的有效来源已经成为人们高度关注的重要课题。目前，血管移植物的临床来源，主要是异体或自体血管以及人工材料，虽然这些材料可以为诸多的病患进行修复血管提供有利的条件，甚至可以更好地延长病患的生命，但是远期效果却未达到预期的理想程度。由于异体或是自体血管的移植分别存有组织相容性比较差，而自体动脉来源也有一定的限制等问题。而人工材料的应用也存在着一定的问题，小口径(内径小于6mm)的血管移植过程之中血管存在着不同程度的高张力、低血流的特殊状态，在病患进行移植之后，其失败率也较高。与此同时，这些人工血管不具备生长以及自我修复功能。 近年来，随着科学技术的迅速发展与进行，组织工程学以分子生物学、生物工程学以及细胞生物学、临床医学为基础，通过生命科学与工程学的基本原理和方法，通过科学、有效的设计、构造、培育以及保养活组织等手段，用以修复或重建病患的相关组织器官的结构，并成为了维持或改善病患组织器官功能的边缘科学。而通过利用该项科学技术，有效地将血管种子细胞与相应的支架材料加以有机结合，则有希望构建出更为理想、有效的组织工程化血管，不但具有较好的与受体组织相容性、还可以维持管腔的长期通畅率，同时还具有良好的自我修复能力以及耐久性、可塑性等优势特性。 组织工程血管，通常是利用细胞外基质作为血管支架，充分、有效地运用组织工程技术，将人工培养的血管内皮细胞种植于血管支架上，再通过相关的技术手段，使之黏附、分化以及正常生长，同时分泌出ECM，从而构建出组织相容性较为良好、无免疫原性、更具较好的持久性与可塑性，，且不易钙化、感染、避免血栓形成的、具有生命力的血管替代物。 Herring[1]等最早地进行了相关人工血管接种血管内皮细胞报道，经过不断的研究也获得了初步成功。然而，由于构建组织工程血管需极大数量的种子细胞，就目前来讲，胚胎干细胞、脂肪干细胞髓干细胞等来源的干细胞均存有不同程度的制约因素，这也促使加强细胞自身的增殖能力，并在较短的时间之内获得更多的种子细胞的问题，也成为了诸多学者所关注的研究课题。尽管，组织工程种子细胞目前主要来自血管壁细胞、内皮祖细胞、骨髓间充质干细胞以及胚胎干细胞，而内皮祖细胞却具有更多的优点，从而被诸多学者认为内皮祖细胞是构建组织工程血管过程中的最佳种子细胞来源。 而支架材料的研究是组织工程血管的另一重要组成部分。组织工程血管要求支架必须具有良好的生物相容性、生物降解性，可以保持完整的三维立体结构，具有一定的机械强度和血管弹性。并且在植入体内后，不与机体发生免疫排斥反应。 本文就种子细胞的来源及自体血管支架的建立进行相关研究。旨在进一步探讨和简化内皮祖细胞的来源，为种子细胞的大量获取提供更多方法。而自体脱细胞血管支架的建立，为血管支架的来源提供了又一新的可能性，为血管组织工程应用于临床提供了新的思路和方法。 第一部分人脐血内皮祖细胞的分离、培养和鉴定 研究目的： 从婴儿新鲜脐带血中进行内皮祖细胞的分离，并对其进行科学的培养与鉴定。本文采用6%羟乙基淀粉沉降法和percoll非连续性密度梯度离心法，在新鲜人脐血中进行内皮祖细胞（EPCs）分离，并将分离出的细胞纯化，在体外进行进一步的培养和增殖。采用相关抗原免疫染色对所培养的人脐血内皮祖细胞进行鉴定。以进一步探寻简化的实验步骤，如何获得足量内皮祖细胞的最佳实验方法，并为实验课题提供充足、健康的内皮祖细胞来源，为下一步实验准备充足的细胞来源。同时，深入探讨人脐血中分离并大量培养内皮祖细胞的可行性以及临床应用价值。 研究方法： 收集蚌埠医学院第一附属医院妇产科足月剖腹产手术胎儿脐带血，无菌条件下放置于含有50U/ml肝素的血清瓶中，放置于4°C冰盒中保存，运送至细胞培养室，采用密度梯度离心法来获取脐带血单个核细胞，将获取的单个核细胞分成两份，加入胎牛血清M199培养基（FCS-M199）及自体血清M199培养基（AS-M199），并分别将其接种于铺设有人纤维连接蛋白（HFN）和未铺设有人纤维连接蛋白的培养皿中（标记为：F(0)、F(1)、A(0)、A(1)）进一步进行体外诱导、分化以及扩增。并观察贴壁细胞在整个诱导分化过程中的形态学变化，结合免疫组化、免疫荧光以及流式细胞仪等相关技术从不同角度对其进行鉴定。 研究结果： （1）培养1~2d后，脐血单个核细胞开始出现贴壁。而在3d之后纺锤形状开始出现，此后贴壁细胞数量逐渐增多，且逐渐变成梭形。当培养至一周时，则形成周围为梭形细胞，而在中央是圆形细胞的典型集落。而在细胞培养至14d时，则出现了互相连接的细胞簇逐渐连接并形成网样结构。与此同时，随着培养时间的不断增加，长梭形细胞也开始逐渐缩短，并呈典型铺路石样改变。 （2）贴壁细胞培养至一周之后继续观察，在铺设有人纤维连接蛋白的培养基之内的细胞数量明显较没有铺设人纤维连接蛋白的多，而在两种不同培养基的细胞数量上无明显变化。 （3）免疫组化：单个核细胞培养至14d之后，贴壁细胞CD31通过FCS-M199培养后其阳性表达率为（88.95±7.23）%；vWF的阳性表达率为（75.01±9.42）%。AS-M199培养的细胞其CD31阳性表达率为(86.79±7.53)%，vWF的阳性表达率为(74.31±7.14)%。 （4）免疫荧光染色：细胞培养至第7d，细胞吞噬DiI-acLDL（+），发出红色荧光；结合FITC-UEA-Ⅰ（+），发出绿色荧光；双染（+）则呈黄色荧光。FCS-M199贴壁细胞双染阳性率（86.56±6.81）%，AS-M199的贴壁细胞双染阳性率（84.47±7.25）%。 （5）流式细胞仪分析提示：第7天时所测定的贴壁细胞表面标志CD133、CD34以及血管内皮细胞生长因子受体-2(VEGFR-2)分别为：（29.35±6.43）%、（52.79±8.01）%、（80.67±6.82）%；而在20天时的分析显示CD133阳性率为(1.52±0.32)%，CD34以及血管内皮细胞生长因子受体-2(VEGFR-2)表达率则分别为（61.48±7.65）%、（91.28±7.98）%。 研究结论： （1）通过密度梯度离心法从脐带血分离单个核细胞，再用VEGF、bFGF等 因子诱导培养，以VEGFR-2、CD133及CD34为标志物进行检测，可获得较为纯化的血管内皮祖细胞。 （2）加入人纤维连接蛋白之后可以有效促进内皮祖细胞贴壁，其细胞贴壁数量明显多于未加入人纤维连接蛋白组。 （3）自体血清M199培养基（AS-M199）可替代胎牛血清M199培养基（FCS-M199）培养EPCs，并取得较佳效果。 （4）CD133在第7天时高度表达，在第20天时基本不表达，我们认为此时血管内皮祖细胞向成熟的血管内皮细胞转变。因此，CD133可作为内皮细胞与内皮祖细胞相鉴别的重要标志。 第二部分改良冻融法脱细胞血管支架的制备 研究目的： 改良传统的冻融制备脱细胞血管支架的技术，并用组织学染色和电镜观察等方法分别对两种不同方法制备的血管支架进行比较。以进一步寻找更安全有效的脱细胞的方法，找到一种操作简便、灭菌效果确实、费用低廉、残留低的脱细胞血管支架制备方法。简化实验步骤，并为血管组织工程实验提供充足、健康的血管支架来源。 研究方法： 收集蚌埠医学院第一附属医院妇产科足月剖腹产手术胎儿脐带，无菌条件下放置于含有PBS液的血清瓶中，放置于4°C冰盒中保存，运送至细胞培养室，剔除脐静脉表面的结缔组织及血管外膜，PBS液清洗后，按下列3种方法制备材料：(1)传统方法：放置15ml塑料冻存管内，置4℃冰箱中预冷1小时，-80℃冰箱冷冻2h，37℃水浴复温30min，上述冻融过程反复进行3次。(2)改良方法：放置15ml塑料冻存管内，置4℃冰箱中预冷1小时，快速浸入-196°C液氮中20min，取出标本放入含50ml无菌蒸馏水100ml的无菌瓶内，置于37℃的气浴恒温振荡箱内，反复振荡，融化30min；同法进行3次，备检测。(3)未处理：直接备检测。 研究结果:（1）大体形态观察：未处理组呈乳白色，管壁淡黄色，弹性良好无塌陷，管腔内表面光滑。传统反复冻融法组材料颜色浅白，管壁稍有塌陷，管腔内表面光滑。改良反复冻融法组材料颜色浅白，管壁无明显塌陷，管腔内表面光滑。三者在大体形态上无明显外观上区别。 （2）HE染色：HE染色、观察，未脱细胞血管壁全层细胞丰富，管腔内面内皮细胞呈单层排列，中层平滑肌细胞胞体细长呈极性排列。传统反复冻融法处理后的血管材料内皮细胞及中膜平滑肌细胞明显变形，破碎；可见细胞核变形、浓染、碎裂等现象。改良反复冻融法处理后的血管材料管壁全层和管腔面无明显细胞残留。 （3）Masson三色染色法：未处理组细胞丰富，胶原纤维结构保持完整。传统反复冻融组细胞仍有部分残留。改良反复冻融组细胞成分大部分被脱去，蓝染的胶原纤维结构保持完整。 （4）电镜扫描结果：未处理组内膜完整，光滑，内皮细胞覆盖完整。传统反复冻融处理组内皮细胞断裂，连续性中断；内膜下胶原结构保持完好。改良反复冻融法血管表面无内皮细胞覆盖，支架表面粗大的胶原纤维束结构保存完好，材料结构致密。 研究结论： 采用改良反复冻融脱细胞方法可以在较短的时间内完全除去支架内细胞成份，且对材料的胶原结构无明显影响。相对于传统的反复冻融处理，改良反复冻融脱细胞血管支架为今后脱细胞血管支架的快速高效制备提供一种新的思路和方法。但关于其抗血流冲击力及远期通畅率等情况还需做进一步的检测。
【关键词】：内皮祖细胞 分离 培养 鉴定 血管组织工程 脱细胞血管支架 组织工程 脐静脉
【学位授予单位】：蚌埠医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329
【目录】：

• 中文摘要5-10
• Abstract10-17
• 第一部分 人脐血内皮祖细胞的分离、培养和鉴定17-40
• 引言17-19
• 材料与方法19-26
• 结果26-32
• 讨论32-35
• 结论35-36
• 参考文献36-40
• 第二部分 改良冻融法脱细胞血管支架的制备40-57
• 引言40-42
• 材料与方法42-46
• 结果46-53
• 讨论53-56
• 结论56-57
• 全文总结57-58
• 参考文献58-61
• 致谢61-62
• 附录A 缩略词表62-63
• 附录B 读研期间发表论文63-64
• 附录C 综述一64-70
• 参 考 文 献68-70
• 附录C 综述二70-83
• 参考文献79-83

【参考文献】

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  本文关键词：人脐血内皮祖细胞的分离、培养和鉴定及改良冻融法脱细胞血管支架的建立，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：319970